一种用于冷冻组织切片多光谱荧光成像的快速方法

该方法有助于在单个冷冻切片中检测并共定位多种生物标志物，包括那些在石蜡切片中通常无法检测到的标志物。通过使用这种实验性染色方法，染色时间显著缩短，且该方法可在任何实验室中进行。本方法将由 Dinesh Jaishankar 进行演示。

他是一位来自实验室的熟练博士后，同时担任免疫治疗评估核心设施的经理。在为分析选择抗体时，需考虑半自动化成像系统上可用的激发和发射滤光片组合。在测试了多种荧光素标记的一抗组合后，应选择合适的荧光素，以尽量减少光谱重叠，具体建议参见表格。

对于多重染色，配制含有相容性荧光染料的抗体混合液，其稀释比例为预先确定的最佳浓度，然后将该混合液加入目标组织切片中。对于单标记染色，仅将偶联有一抗的抗体加入载玻片。所有染色均需设置对照非染色载玻片，即经历相同的染色流程但不加入偶联一抗。

室温避光孵育一小时后，用 PBS 洗涤载玻片两次，每次洗涤五分钟。第二次洗涤后，将多重染色的载玻片在室温避光条件下用 DAPI 复染七分钟，随后用 PBS 洗涤两次，每次五分钟。为建立光谱库，将多光谱成像系统的光源功率设置为 100%，并打开显微镜操作软件。

选择编辑方案并新建方案。输入方案名称，并在成像模式下选择荧光。然后提供研究名称，并将单染色玻片加载到载物台上。

单击“编辑曝光”，使用自动对焦和自动曝光选项调整曝光时间，并为单染色切片采集快照。成像单染色切片后，保存该实验方案。然后在机器学习软件的“构建文库”选项卡下，加载每一张单染色图像。

选择适当的层并点击提取。软件将自动提取所选层中的荧光信号。如需保存提取的颜色，请点击保存以进行存储。

可以创建一个新组，或将提取的颜色存储到现有组中。对于多光谱成像，在创建并验证光谱库后，按照演示调整多重染色切片的焦距和曝光时间，并打开已扫描的切片以创建新任务。提供切片编号并选择一个实验方案。

在任务中，选择全片扫描，以对多重染色切片进行全片扫描。在全片扫描图像中，选择覆盖整个图像的感兴趣区域。这些区域将使用先前在多重染色切片上设定的曝光时间进行扫描，用于光谱解混和分析。

在显微镜操作软件中，于任务下选择采集 MSI 视场，然后点击处理载玻片，以 20 倍放大倍数获取感兴趣区域。完成感兴趣区域采集后，在机器学习软件的手动分析选项卡中，点击文件和打开，以加载多重染色图像。选择光谱库来源，点击选择光谱库，选取先前保存的光谱库。

单击“文件”并选择“打开”，以加载未染色的图像。然后单击自发荧光墨水标记图标，在未染色的切片上绘制一条线或区域，以识别组织内的自发荧光。接着在“编辑标记与颜色”选项卡下，为每个标记分配名称，然后单击“准备全部”。

在验证光谱解混图像后，在机器学习软件中，从面板中选择细胞质膜和标记物选项。然后使用省略号按钮，选择“使用此信号来查找”，以配置标记物用于检测细胞核、细胞质或细胞膜。当选择细胞质或膜标记物时，选择“使用信号辅助细胞核分割”选项。

软件将自动检测并为细胞核、细胞质和细胞膜创建独立的掩膜。使用软件中特定标记的病理学视图和配置选项来调整掩膜，然后单击“分割全部”以生成细胞分割图。完成细胞分割后，选择标记以表征阳性细胞。

此外，选择至少五个未被所选标记染色的细胞，以表征阴性细胞。然后点击“训练分类器”以训练软件，自动检测图像中所有被选定标记染色的细胞。系统将生成一张表型图谱。

如这些图像所示，经过流式细胞术验证的抗体可用于在半自动成像系统中结合液晶可调滤光片对组织染色进行可视化观察。此处可观察到一张经光谱拆分的人类扁桃体冷冻组织图像，其中显示了滤泡生发中心内的B细胞和增殖细胞，以及滤泡间T细胞区域的标记。病理学视图选项可分别显示每种标记物在目标组织中的单独染色模式，表明多重染色方法与光谱成像技术在冷冻组织上具有可行性。

如在小鼠肿瘤冷冻切片上的演示所示，多光谱成像还可用于可视化肿瘤浸润性T细胞及其他髓系细胞谱系，包括与肿瘤相关的巨噬细胞。软件可生成细胞分割图、表型图谱，以及针对每种标记物分析出的染色细胞数量，表明该软件可用于对冷冻组织上的多光谱染色进行定量分析。对于初次接触该技术的研究人员而言，了解所用荧光染料的特定特性，并制备高质量的光谱库切片以实现最小光谱重叠的光谱分离，至关重要。

进行抗体滴定也非常重要。我们认为，该方法可以在床旁提供有关癌症免疫治疗及其他治疗应用效果的信息，尤其是在时间至关重要的情况下。