机械分离与溶解鸡卵外层和内层卵周质亚层中的蛋白质

本方案提供了从禽蛋中采集卵周膜亚层的逐步操作流程，以进一步研究其在鸟类繁殖中的生理作用。每一步的卵周膜采样均经过优化，以最大限度减少任何结构和分子层面的损伤。该方案还进一步完善，适用于深入的蛋白质组学研究。

首先，从新产的未受精卵中采集卵周隙层（perivitelline layer，简称 PL）。将鸡蛋打破后，使用蛋清分离器将蛋黄与蛋清分离。用小剪刀去除系带，并将蛋黄在滤纸上滚动，以除去附着的蛋清，这些蛋清呈现为透明但可见的结构。

将卵黄浸入含有10毫摩尔Tris HCl（pH为8）的结晶皿中，该溶液已预先冷却至4摄氏度，使用钝头剪刀在胚盘区域周围1厘米范围内去除浆膜层（PL）。在缓冲液内用小剪刀刺破浆膜层，然后用镊子夹住破裂浆膜层的两侧边缘，将其从卵黄上剥离。用10毫摩尔Tris HCl溶液多次冲洗浆膜层，直至看不到任何卵黄残留痕迹为止。

确保 PL 清洁、呈白色且在缓冲液中漂浮。对 PL 进行亚层分离，或直接进行生化分析。为分离 OPL 和 IPL，将整个样品展开，OPL 朝上置于盛有 10 毫摩尔 Tris HCl 和 50 毫摩尔氯化钠的塑料培养皿中，并尽量保持平整，减少皱褶。

确定仅附着于外颗粒层（OPL）的剩余卵黄膜的位置。然后用小剪刀将整个颗粒层（PL）剪成约2厘米×3厘米的碎片。在解剖显微镜下，使用超精细尖头镊子将两层结构机械分离。

将获得的IPL和OPL样品分别储存于微量离心管中，置于负80摄氏度条件下，直至后续使用。为进行初级蛋白质溶解，需将IPL和OPL样品分别进行冷冻干燥以去除残留水分，然后从每份样品中切取约1毫克，放入带有防漏螺旋盖的洁净微量离心管中。剩余样品应保存在密封严密的管中，于负20或负80摄氏度长期储存。

将每种冻干的亚层各取一毫克，与400微升pH为7、50毫摩尔的Tris溶液和500毫摩尔的氯化钠混合。使用混合研磨仪在30赫兹条件下处理两次，每次5分钟，以将结构破碎成微粒并促进蛋白质溶解。将400微升样品收集到两个洁净的微量离心管中。

为电泳制备样品时，向每个400微升的样品中加入5X SDS-PAGE上样缓冲液，并在100摄氏度加热5分钟。将最多20微克的蛋白质上样至4–20%梯度SDS聚丙烯酰胺凝胶的每个泳道中，在120伏电压下进行电泳。电泳结束后，将凝胶从玻璃板间取出，用考马斯亮蓝染色液染色30分钟，然后用含50%水、40%乙醇和10%乙酸的脱色液脱色，直至凝胶背景呈现浅蓝色。

将凝胶转移至含有去离子水的培养皿中进行脱色和再水化。蛋白质应呈现为蓝色条带，背景透明。PL 经过多种缓冲液处理，以确定可实现最小蛋白损失和最佳亚层分离的条件。

此处展示了在不同 Tris 浓度、pH 值和氯化钠浓度下释放的蛋白质。在解剖显微镜下观察到两个子层。内丛状层（IPL）呈半透明状，而外丛状层（OPL）则致密、浑浊且呈白色。

分离后，OPL和IPL分别进行冻干处理，并通过机械研磨、阴离子去垢剂、还原剂及加热煮沸的组合方法将其中的蛋白质完全溶解。样品在聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈现出明显的电泳图谱差异。在实施本方案时需注意，亚层的分离是该操作的关键步骤，必须在含有最低盐浓度的缓冲液中，借助双目显微镜完成。

为进一步阐明其各自的生理功能，可采用电子显微镜对卵周膜亚层样本进行组织学表征分析，并利用成像检测和细胞迁移实验开展功能研究。