小鼠细菌性眼内炎模型中的玻璃体内注射及感染参数定量分析

本方案可重复地将微生物和治疗剂导入小鼠眼内，以研究眼内感染的发病机制及新型治疗方法的有效性。本技术可在小鼠模型中建立眼内感染，并有助于定量分析微生物、宿主免疫反应、感染相关宿主与病原体基因表达以及新型治疗手段的效果。注射部位、针头角度及给药过程的可视化对于成功实施该技术至关重要，而规范的眼组织采集则是准确量化感染参数的前提。

在生物安全二级实验室内，向一个10毫升带盖离心管中加入5毫升BHI肉汤，并使用无菌接种环从划线平板培养物中转移单个蜡样芽孢杆菌（B. cereus）菌落至5毫升肉汤中。短暂涡旋混匀后，将样品置于37摄氏度、200转/分钟的旋转培养箱中培养18小时。培养结束后，用新鲜BHI肉汤将菌液稀释至每微升含200个菌落形成单位（CFU/µL）的浓度，涡旋混匀后，取1毫升新鲜稀释的菌液加入预冷的1.5毫升微量离心管中，置于冰上备用。

进行玻璃体内注射时，打开微量注射器，并开启连接在微量注射器上的压缩空气罐的气体阀门。按下微量注射器上的“模式”（Mode）键，直至屏幕显示“平衡”（Balance）。按下“平衡”（Balance）键，并将计算机鼠标放置在手术台上。

将不锈钢移液管支架连接到注射器填充输出端的管路上，并将移液管支架接头紧密地拧在斜面玻璃毛细移液管尖端针头上，以便将毛细针插入移液管支架的另一端。打开眼科显微镜，将光照强度设置为50%。将显微镜置于操作区域上方，并调节显微镜至所需焦距。确认小鼠对足底反射无反应后，将麻醉后的小鼠左侧卧位放置于医用垫巾上，鼻部朝向右侧。

通过眼科显微镜物镜定位右眼，并将反向持针钳的钳夹置于眼球两侧，以暴露注射部位。点击连接至显微注射仪的鼠标左键，使已准备好的毛细玻璃针头吸入稀释的细菌溶液。用左手固定头部，将针尖（斜面朝上）置于角膜缘处。保持针头与眼球呈45度角，刺入眼球，注意仅将针尖锐利部分的0.5毫米插入即可。

针尖插入后，用左手点击触控板右键，注入 0.5 µL 的 B.cereus 溶液。为防止液体渗漏，将针尖在小鼠眼内保留 2 至 3 秒后再拔出，随后松开镊子，眼球将自行回到眼窝内。将小鼠转移至带有加热垫的恢复笼中，并持续监测直至完全恢复卧姿。

在适当的实验终点，向置于冰上的预标记灭菌收获管中加入 400 µL 含蛋白酶抑制剂的 PBS（每只眼球一管），并将精细尖头镊子张开置于感染眼的两侧。将镊子尖端向下朝头部方向推动，使眼球突出。当镊子尖端到达眼球后方时，夹紧镊子并向头部外侧拉动，以摘除眼球。

立即将眼球放入相应标记的采集管中。在样本采集后60分钟内，将封闭的采集管放入组织匀浆器中，以两个一分钟的匀浆周期进行匀浆，每个周期之间间隔30秒休息时间。匀浆完成后，将样本置于冰上，并取20微升匀浆液作为分装量，每步用180微升磷酸盐缓冲液（PBS）进行连续稀释，直至达到1×10⁻⁸的稀释倍数。

接下来，用记号笔在方形预热的BHI平板的每一行上标记相应的稀释浓度。将平板倾斜45度角，取10 µL每种稀释液分别加入平板顶部的各自行中。让每份样品沿斜面缓慢向下流动，直至接近平板底部时，再将平板平放。待样品完全被琼脂吸收后，将平板转移至37 °C培养箱中培养。

孵育 8 小时后应开始可见菌落。为准确反映样品中的浓度，应计数含有 10 至 100 个菌落的区域。斜面玻璃针尖的制备对于将细菌注入小鼠眼球玻璃体中部至关重要。

这些图片显示了在血琼脂平板和肉汤培养管中生长的蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）。如图所示，在感染后10小时，从小鼠的五只不同眼睛中测得的眼内细菌数量通常可从单个感染眼回收到1×10⁵至1×10⁷个菌落形成单位。进行此操作时最重要的是要将适量的细菌注入小鼠眼内。

通过该实验流程，我们可利用组织学方法研究炎症，通过ELISA检测炎症介质，并通过高通量RNA测序分析基因表达，从而促进对该疾病发病机制的深入理解。