大鼠骨骼肌中纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）与肌源性祖细胞（MPs）的鉴定、分离与表征
2021年6月9日
本方案概述了一种从大鼠骨骼肌中分离纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）和肌源性祖细胞（MPs）的方法。在肌肉损伤模型中使用大鼠可提供更多的萎缩肌肉组织用于分析，并具备更丰富的已验证方法，用于评估自由活动动物的肌肉力量和步态。
由于FAPs是肌肉再生和病理性纤维化的重要中介因子，本方案可实现对肌肉损伤后FAP动态变化的表征，并可用于体外或离体研究中FAPs的分离。迄今为止，相关研究均仅基于从小鼠中分离的FAPs。本方案能够高效地从体型更大的大鼠中分离FAPs，从而为后续检测提供更充足的组织来源。
过长的组织处理时间可能对FAPs的活力产生不利影响。若同时处理多个样本，建议由两名操作人员协同进行实验操作，以最大程度地维持分离细胞的活力。首先，将收获的肌肉组织置于无菌的10厘米细胞培养皿中。
用镊子轻轻撕碎组织并剪成小块，去除结缔组织，获得约三到四立方毫米大小的组织块。将剪碎的组织转移至含有六毫升 DMEM 和 1% 青霉素-链霉素的无菌 50 毫升锥形管中。接着，通过加入 10 微升 300 毫摩尔氯化钙溶液，激活 365 微升胶原酶 II 溶液。
将激活的胶原酶II溶液加入组织匀浆中，使终浓度为每毫升250单位。将试管置于37摄氏度、240 × g 条件下振荡孵育1小时，每15分钟手动震荡一次，以使黏附在管壁的组织脱落。孵育1小时后，向样品中加入100微升胶原酶II和50微升分散酶。
然后，使用血清移液管将样品反复吹打15至20次，直至溶液均匀。将样品在37摄氏度、240 × g条件下再次孵育30分钟，每15分钟手动振荡一次。使用带有20号针头的20毫升注射器，将肌肉溶液样品缓慢剪切10个循环。
然后，将一个40微米的细胞筛置于无菌的50毫升锥形管上，并通过移液加入5毫升含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基润湿筛网。每次移取1毫升样品，通过筛网过滤。待全部样品过滤完毕后，用含10%FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基冲洗细胞筛，使样品总体积达到25毫升。
将样品体积均分为两份，分别加入两个15毫升的锥形管中，在15摄氏度、400 × g条件下离心15分钟。离心后，吸除上清液，并将沉淀物重悬于1毫升室温的红细胞裂解缓冲液中，孵育7分钟。随后，加入9毫升洗涤缓冲液，使总体积达到10毫升，在15摄氏度、400 × g条件下再次离心15分钟。
离心后，吸除上清液，并将沉淀物重悬于1毫升洗涤缓冲液中。取适量细胞转移至另一个1.5毫升微量离心管中，与台盼蓝染料混合。使用血细胞计数板在光学显微镜下计数活细胞。
进行流式细胞术时，将每份实验样品的1至200万个细胞转移至无菌的1.5毫升微量离心管中。用洗涤缓冲液将样品体积调至1毫升，并将试管置于冰上。设置实验所需的所有对照。
对于细胞对照，将500,000至100万个细胞分装至1.5毫升微量离心管中，加入1毫升洗涤缓冲液，置于冰上。若为首次进行实验，还应包括单染细胞悬液。为设置微珠对照，向每个标记的1.5毫升离心管中加入约150,000个阳性补偿微珠。
通过将活力检测管中一半的细胞体积转移至新标记为“dead”的1.5毫升微量离心管中，制备活力对照。将“dead”管在65摄氏度孵育2到3分钟，然后置于冰上。孵育结束后，将失活的细胞重新返回至活力检测管中。
将单细胞悬液（包括实验组和对照组样品）在4℃条件下以500 × g离心5分钟，吸去上清液后，用100 µL洗涤缓冲液重悬细胞沉淀。根据对照组或实验组条件加入抗体，轻轻弹动样品管以确保充分混匀。随后将样品置于冰上避光孵育15分钟。
对于补偿微珠，将试管置于室温避光孵育15分钟。向单细胞悬液中加入900 µL洗涤缓冲液，向补偿微珠对照中加入900 µL PBS，使各管体积均调整至1 mL。将单细胞悬液在500 × g、4 °C条件下离心5分钟，补偿微珠对照在300 × g、4 °C条件下离心5分钟。
样品离心后，吸弃上清液，将细胞沉淀重悬于 300 µL 洗涤缓冲液中，将磁珠对照重悬于 300 µL PBS 和 150,000 个阴性补偿磁珠中。将细胞样品置于冰上，磁珠样品用铝箔包裹后置于室温下。通过设置门控策略进行流式细胞术检测，以鉴定成纤维-脂肪生成祖细胞和肌源性祖细胞。
在代表性分析中，通过使用补偿微珠和来自健康大鼠腓肠肌的单细胞悬液进行单染色，证实了Sca-1 APC抗体的成功偶联。在单细胞悬液上滴定五种不同浓度的Sca-1 APC，并根据荧光强度最强且背景染色最小的原则确定抗体的最佳浓度。采用此处所示的设门策略，对大鼠腓肠肌中的FAPs和MPs进行流式细胞术鉴定。
首先对样本进行设门，以排除计数微球中的碎片。然后根据前向散射和侧向散射特征对细胞进行设门，以排除双联体。通过SYTOX Blue染色评估所得细胞的活力。
通过CD31和CD45对SYTOX Blue阴性单细胞进行分析，以排除Lin+细胞群。对Lin-细胞群进行检测。仅Sca-1单阳性细胞定义为FAPs，仅VCAM-1单阳性细胞定义为MPs。
分选后立即进行共免疫染色显示，新分离的FAP群体对PDGFRalpha呈阳性染色，且无Pax7阳性细胞污染。相反，分选后的MP群体对Pax7呈阳性染色，且无PDGFRalpha阳性细胞。在成脂分化培养基中培养至第12天时，FAPs分化为成纤维细胞和脂肪细胞，分别表达成纤维细胞特异性蛋白1和perilipin 1。
通过油红O染色可明显观察到成熟脂肪细胞中存在中性甘油三酯和脂质。此外，脂肪间质细胞（FAPs）表现出I型胶原的存在，且无污染的肌细胞。在成肌分化培养基中培养至第12天的肌源性细胞（MPs）显示出成熟肌细胞和融合的多核肌管的存在，且无成纤维细胞和脂肪细胞污染。
采用该技术分离活细胞用于长期培养时，研究人员必须在确保无菌操作的同时高效工作，以保证细胞具有良好的存活率。
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概述
本方案概述了一种从大鼠骨骼肌中分离纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）和肌源性祖细胞（MPs）的方法，重点针对肌肉损伤模型以提高组织可获得性。该方案可有效分离并表征损伤后FAP的动态变化，为体外和离体研究提供重要信息。
关键研究组成部分
研究领域
- 细胞生物学
- 肌肉再生
- 病理性纤维化
背景
- FAPs 在肌肉恢复和病理状态下起着关键作用。
- 以往的研究主要使用小鼠模型；本方案将重点转向大鼠。
- 大鼠提供的组织量更充足，有利于下游检测的开展。
使用的方法
- 离心和胶原酶处理用于细胞分离
- 大鼠骨骼肌作为生物模型
- 流式细胞术用于FAP和MP的鉴定
主要结果
- 成功从大鼠肌肉组织中分离出具有活性的纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）。
- 损伤后对FAP和肌肉前体细胞（MP）群体的表征。
- 经验证的实验方案和条件可提高细胞存活率。
结论
- 本研究展示了分离和分析肌肉前体细胞的有效方法。
- 这些发现对于理解肌肉健康与疾病具有重要意义。
常见问题
行业重要性概述
在大鼠骨骼肌中稳健地鉴定和分离纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）和肌源性祖细胞（MPs），可实现对肌肉损伤与再生过程更高保真度的建模，从而支持转化研究和靶点验证。该方案具有可扩展性且组织得率高，可解决肌肉疾病研究领域下游检测开发和机制性风险排除中的关键瓶颈。这一能力有助于提升肌肉靶向治疗药物在早期发现和临床前关键节点的预测可靠性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可探究FAP和MP在肌肉再生和纤维化中的作用。
- 通过分离纯化的细胞群体用于机制研究，支持靶点的功能性验证。
- 通过阐明损伤后前体细胞的动态变化，有助于预测性降低研发风险。
筛选与检测方法开发
- 提供经过验证的物种特异性细胞群体，用于可重复的体外和离体实验。
- 标准化基于流式细胞术的设门策略和抗体验证，适用于大鼠肌肉模型。
- 实现对细胞活力和分化潜能的定量评估，以确保实验的可用性。
转化与临床前研究
- 通过在大鼠肌肉损伤和萎缩模型中开展纵向研究，与疾病相关模型保持一致。
- 通过提供可扩展的组织和细胞来源，支持从发现到临床前验证的连续性研究。
- 通过在大鼠中实现系列性、非终末性的功能评估，提高基于风险调整的推进决策质量。
流程与工作流整合
本方案通过实现大鼠模型中肌肉前体细胞的分离、表征及后续功能分析，融入了从发现到临床前研究的连续过程。
- Discovery Biology：支持对前体细胞功能及信号通路在肌肉修复中作用的假设验证。
- Screening：提供可重复、定量的基于细胞的检测输入，用于化合物评估。
- Analytics：提供基于流式细胞术的读数以及免疫染色验证，用于比较研究。
- Translational Research：促进与肌肉损伤和再生模型中疾病相关终点的对接。
- Enterprise Reuse：建立可在多个研究项目中重复使用的鼠源肌肉前体细胞分离方案。
运营与企业影响
- 科学价值：提高肌肉生物学研究的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：增强细胞分离工作流程的标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：提升靶向肌肉的研发项目中“推进/终止”决策的质量与资本使用效率。
- 项目组合影响：实现基于风险调整的肌肉疾病项目优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备流式细胞术、抗体偶联和细胞培养技术方面的专业知识。
- 需要获得经过验证的适用于大鼠模型的抗体以及相应的分析基础设施。
- 需要跨团队统一门控策略和细胞活力对照的标准操作流程。
- 对于高度纤维化或去神经支配的肌肉组织，可能需要进行方法调整。
- 细胞活力对处理时间和操作人员的操作效率较为敏感。
