棘鼠模型中纤维脂肪生成祖细胞的分离、扩增与分化

我们的总体目标是更深入地理解并掌握细胞间的通讯与细胞行为，从而揭示组织稳态的机制，以及在FAP修复过程中细胞过程如何发生异常调控。为实现这一目标，我们正在使用多种模型，其中之一是刺鼠。这种新型小鼠模型面临的主要问题之一是缺乏可用于研究的工具。

本文提供了一种新方案，包含可靠的酶消化和抗体染色步骤，使我们能够成功分选纤维脂肪生成祖细胞，并在体外进行培养，以进一步分析其命运。我们已测试了多种酶的组合与浓度以及多种抗体，本方法为目前最可靠且稳健的实验方案提供了参考。由于现已建立了可靠的酶消化方法，我们将继续筛选其他标志物和抗体，以成功分析内皮细胞、周细胞、免疫细胞及肌源性细胞。

首先，将已处死的小鼠仰卧位放置于解剖台上。用70%乙醇彻底喷洒小鼠的毛发。在腹侧正中线处做一个2至3厘米长的纵向切口。

暴露肋骨和腹肌。然后使用组织剪在剑突处剪开肌肉，暴露膈肌。接着在两侧剪开膈肌和肋骨。

用止血钳夹住并掀开剪断的肋骨，用组织剪在右心房上剪一小口，然后将连接20 mL注射器的23号针头插入心尖部位。

缓慢向心脏注入 20 mL 的 2 mM PBS EDTA。取出心脏并置于含有冰冷 PBS 的 60 mm 培养皿中，冰上保存。去除心房，并尽可能冲洗掉血液。

接下来，去除小鼠膝关节上方的皮肤。用一对精细镊子去除筋膜。使用剪刀以股骨为引导分离股四头肌。

然后将股四头肌转移至另一个含有冷PBS的培养皿中。首先，向含有小鼠心脏组织的5 mL转运管中加入2 mL消化缓冲液，并向含有小鼠骨骼肌组织的15 mL离心管中加入4 mL消化缓冲液。将从多刺鼠分离的心脏和股四头肌组织放置在培养皿的盖子上。

用组织剪将组织剪切成小于1立方毫米的小块。将剪碎的组织转移至相应的消化管中。以低速涡旋振荡管内内容物两秒钟。

20分钟后，从旋转仪上取下离心管。让组织碎片自然沉降。使用P1000移液器吸除上清液。

将上清液转移至含有20 mL预冷FACS缓冲液的50 mL离心管中。用相应体积的消化缓冲液补充分别的消化管。再次在旋转仪上孵育。

将肌肉组织再次进行消化后，加入冰冻的FACS缓冲液以终止消化反应。将一个孔径为40微米的细胞滤网置于50 mL离心管上方，将消化后的悬液及上清液通过滤网过滤。

将细胞悬液在 4 °C 下以 500 ×g 离心 8 分钟。去除上清液后，向沉淀中加入 3 mL ACK 裂解缓冲液并重悬。将悬液置于冰上孵育 5 分钟。用 FACS 缓冲液定容至 40 mL。

将样品在 4 °C 条件下以 500 ×g 离心五分钟。倾去上清液后，用 0.5 mL FACS 缓冲液重悬沉淀。最后，将悬液通过装在 5 mL 聚苯乙烯圆底管上的 40 µm 细胞滤筛帽过滤。首先，配制 30 L 染色缓冲液，其工作浓度为 2 倍，用于单色和 FMO 对照。

将单色和FMO对照染色缓冲液转移至96孔板的孔中。用20 µL FACS缓冲液补足体积。为染色样本，于1.5 mL离心管中配制0.5 mL的2× FACS染色缓冲液。

吸取10 µL细胞悬液分别加入单色和FMO对照孔中。然后向剩余的细胞悬液中加入2x FACS染色缓冲液并进行孵育。接着，向各孔中加入100 µL FACS缓冲液，向样品管中加入2 mL缓冲液。

在 4 °C 条件下以 500 ×g 离心五分钟。吸除上清液，然后将细胞沉淀重悬于活力缓冲液中。向 1.5 mL 离心管中加入 300 µL 增殖培养基。这些离心管将用作细胞分选的收集管。

使用FACS分选细胞后，在4 °C条件下以800 ×g离心10分钟。用P1000移液器小心吸除上清液，避免扰动沉淀。将沉淀重悬于增殖培养基中，调整终浓度为每微升100个细胞。将细胞悬液接种至48孔组织培养板的各孔中。

最后，将培养板转移至37 °C的培养箱中，在相应的气体条件下培养，直至细胞融合。培养5天内可获得具有典型成纤维细胞形态的融合细胞。