卵巢组织中细菌的表征与功能预测

本方案旨在发现卵巢组织中的细菌并预测其功能。采用免疫组织化学染色和16S rRNA测序技术，以原位发现并区分癌变与非癌变卵巢组织中的细菌。通过利用BoPs及通过重建未观测日志进行的细胞遗传学群落分析，预测细菌的互补性与功能差异。

本方案旨在原位提取卵巢组织中的细菌，也可用于发现各种类型的肿瘤组织中的细菌。本方案的主要优势在于操作简便、易于实施，几乎可在所有实验室中完成。

获得结果的速度也很快。在实施该方案的过程中，重要的是要排除任何来自非肿瘤组织的细菌。因此，本方案中的所有操作步骤都必须保持无菌。

手术过程中，使用一把新的无菌镊子将切除的卵巢组织分离成厚度约为1厘米的组织样本。整个操作过程中避免接触其他任何物品。分离后，将样本转移至无菌管中，并置于液氮中以备转运。

将样品保存在负80摄氏度。用甲醛固定组织，然后用石蜡包埋。本方案可在此处暂停。

组织可在室温下长期保存。为了进行后续操作，将样品切成5 µm的连续切片，然后将样品干燥。

对样品进行脱蜡和复水。为恢复抗原，需在EDTA缓冲液中进行10分钟的微波处理。将样品浸入含有0.3%过氧化氢的PBS中。

过氧化20分钟以终止内源性过氧化物酶活性。使用浓度为1:300的LPS核心抗体EMA，于4°C孵育过夜。

为了检测细菌的存在，使用DAP底物试剂盒来检测HRP的存在。根据生产商说明书，使用HRP聚合物和抗兔抗体。使用浓缩板使抗体充分结合。

使用 PBS 去除未结合的抗体。根据制造商说明书进行化学染色，然后用水冲洗样品。对样品进行脱水处理。

通过测序对样品进行分选。使用Imaging Pro Plus软件将样品制备成文库，具体操作依据制造商的说明书进行。设计引物序列，该序列由基因特异性序列和Illumina接头悬垂核苷酸序列组成。

为了扩增细菌16S rRNA基因序列V4区的出生率，使用扩增子PCR对DNA样本输入的模板进行扩增。使用Mag-Bind RxNPure Plus磁珠去除PCR产物中的反应混合物。再次进行加索引的PCR扩增。

使用 Agilent 2200 TapeStation 检测文库。使用 QuantiFluor dsDNA 系统对文库进行定量。采用 600 个循环的 v3 标准流动池可产生约 100,000 对末端测序数据。

2 次 300 碱基 3。文库经过去归一化处理后合并并进行测序。使用 Trimmomatic 根据测序质量对每个样本的原始数据进行过滤。

应去除引物和接头序列。成对序列读长及其质量值均低于25的应进行截短处理。使用QIIME软件包分析16S rRNA序列。

以97%的相似性阈值将序列聚类为OTU。对于每个OTU，应在各样本中计算其相对丰度。采用基于RDP训练集的贝叶斯分类器对所有序列进行分类。针对给定的OTU，将其分配给具有主要序列一致性的分类。

基于样本分组信息，将OTUs比对至Silva数据库。进行α多样性分析以及基于UniFrac的主坐标分析。使用BugBase预测细菌特征的相关表型表现。

在PICRUSt中预测宏基因组的功能组成。利用监测数据和包含参考基因组的数据库，借助STAMP软件分析各组之间的不同功能。使用一种统计软件计算结果。

统计学显著性应定义为 p 值小于 0.05。使用 Student t 检验计算包括年龄和产次在内的混杂因素。使用卡方检验计算绝经状态、高血压史和糖尿病史。

采用 Mann-Whitney U 检验计算卵巢细菌分类群的数量。本研究共纳入16例患者。使用 BugBase 进行预测宏基因组分析的实践。

利用抗细菌LPS抗体对卵巢进行潜在致病性及免疫组织化学分析。该图显示了癌症组与对照组中细菌的丰富度和多样性，通过16S rRNA测序揭示。

图中分别为观测到的物种数指数、Chao1指数、ACE指数、Shannon指数、均匀度指数、Simpson指数。本图展示了卵巢样本中门水平的相对丰度以及12种最丰富的细菌物种。

图A、B、C和D。表示对照组与卵巢癌组患者卵巢中菌群的相对丰度。对照组患者与卵巢癌组患者卵巢中丰度最高的十二种细菌物种的相对丰度。这是最常见的结果，采用PCoA聚类分析，并显示西伯利亚厌氧盐菌（Anoxynatronum sibiricum）和含泡甲烷八叠球菌（Methanosarcina vacuolata）的相对丰度。

图A显示了使用PCoA进行聚类的常见群落。PC1和PC2分别绘制在x轴和y轴上。红色区块代表卵巢癌组中的样本。

蓝色圆圈代表对照组中的一个样本。卵巢癌组的样本可以与对照组中的其他样本区分开来。图B显示了使用PCoA聚类的共有类群。

PC1 和 PC2 分别绘制在 x 轴和 y 轴上。红色方块代表卵巢癌组中的一个样本，蓝色实心圆代表子宫肌瘤患者的样本。

蓝色空心圆代表一位患有子宫腺肌症患者的样本。图C显示西伯利亚厌氧钠单胞菌（Anoxynatronum sibiricum）的相对丰度。图D为含泡甲烷八叠球菌（Methanosarcina vacuolata）。

该图是基于预测宏基因组学的 BugBase 分析结果。癌变组卵巢的潜在致病性和氧化应激耐受表型强于对照组。该图显示通过 PICRUSt 分析得到的癌变组与对照组之间在 KEGG 通路空间上存在显著差异。

收到样本后，需要使用一对新的无菌镊子。注意避免样本受到污染，因为肿瘤组织外的细菌可能会极大地影响结果。

建议在每一步骤中均设置对照组，以减少潜在污染的影响。