异质性三维 体外 卵巢癌起始与进展过程中间质-上皮相互作用的建模

以下实验的总体目标是构建卵巢癌早期发展阶段的三维典型模型。首先，建立来源于原代正常卵巢上皮细胞和成纤维细胞组织的 Hturt 永生化细胞系。随后，通过在三维 S 类球体模型中对上皮细胞和间质细胞系进行共培养，以重建体内卵巢中存在的组织结构及复杂的细胞间相互作用。接着对类器官培养物进行固定和染色，并分析特定标志物的表达，以研究间质-上皮相互作用的分子特征。

结果表明，三维典型模型中基质细胞区室的改变可影响共培养上皮细胞的表型。三维典型模型有助于解答卵巢癌研究领域的一些关键问题，例如探索该疾病的起源，以及阐明基质微环境在肿瘤发生和发展中的作用。相较于其他三维培养方法，这些技术的应用还可拓展至疾病诊断与治疗领域。

该技术可应用于更广泛的细胞培养体积及后续应用。例如，3D同型培养可用于体外药物筛选。该方法也可拓展至其他模型系统，如用于研究其他类型的实体瘤或良性疾病。

将新鲜的卵巢组织置于添加了额外抗生素和抗真菌剂的永生化正常卵巢成纤维细胞培养基中，运送至细胞培养实验室。用五毫升磷酸盐缓冲液（PBS）清洗样本三次，以去除仍松散附着在组织上的任何上皮细胞。接着，将样本连同PBS一起转移至一个干净的P 100培养皿中。使用无菌器械，将组织转移至第二个干燥且洁净的P 100培养皿中。

将组织切成0.5平方厘米的碎片，每块放入一个独立的P 100培养皿中。继续将组织切割成小于1平方毫米大小的碎片。然后加入20毫升INOF GM培养基，并通过相差显微镜观察细胞生长情况。

在24小时内确认细胞已贴壁。使用相差显微镜监测细胞生长，细胞通常在24小时内贴附于培养皿。一周后，通过抽吸去除未贴壁的组织，更换培养基，此后在细胞集落大小约为500微米的一至三周内，每周更换培养基两次。

使用三联管和包被的克隆环分离克隆。为确认细胞为100%成纤维细胞，取部分细胞系接种于玻璃盖玻片上，并对成纤维细胞标志物、上皮细胞标志物以及内皮细胞标志物进行免疫荧光染色。

在对 H Turt 传代细胞进行逆转录病毒转导前一天，将正常卵巢成纤维细胞从一个 P 100 培养皿传代至三个 P 100 培养皿中。预制成的病毒上清液可通过商业途径购买，或按照标准共转染 HEC 2 9 3 T 细胞的实验方案在实验室内部制备。制备聚羟基乙基甲基丙烯酸酯（poly Hema）溶液时，称取 1.5 克 poly hema，放入无菌瓶中。

加入95毫升分子生物学级无水乙醇和5毫升细胞培养级蒸馏水。将聚HEMA溶液置于65摄氏度水浴中，直至完全溶解。用新配制的聚HEMA溶液包被组织培养皿。

在超净工作台内将细胞培养皿风干。对于较大尺寸的培养皿或培养瓶，可使用摇床轻轻摇动，以确保表面包被均匀。若多聚赖氨酸溶液干燥过快，表面将无法保持平整。

如有需要，可在进行三维培养之前对成纤维细胞进行预处理，例如，为诱导细胞衰老，可用亚致死剂量的过氧化氢预处理细胞。在体外复苏并扩增诱导型成纤维细胞（INOF）和上皮细胞培养物，以获得足够数量的细胞用于建立三维异位类器官。用 PBS 洗涤五分钟后，向聚羟基乙酸（poly hema）培养板中加入 15 毫升培养基。

同时，向永生化的正常卵巢成纤维细胞中加入胰蛋白酶，使其从培养皿上脱落。3至5分钟后，加入等体积的培养基中和胰蛋白酶，并通过离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于5 mL培养基中，通过反复吹打或轻轻涡旋充分混匀。

然后取10微升样品，用台盼蓝计数法测定活细胞数量。将400万个INOF细胞加入已分装至聚HEMA包被板中的培养基中。将培养基体积补至20毫升，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养。

通过相差显微镜监测细胞聚集形成多细胞类固醇结构，以确定每隔两到三天重新换液的时间点。将培养板倾斜静置于移液器上，使类球体沉降，然后用5毫升移液器小心移除约16毫升的耗尽培养基。

在第7天，向培养物中加入16毫升新鲜培养基，并放回培养箱。通过将上皮细胞添加到成纤维细胞PHE中来建立异型培养物。首先，在对细胞计数后，按照前述方法用胰蛋白酶制备卵巢上皮细胞悬液。

用无生长因子的GM培养基洗涤一次，以防止上皮细胞培养基中的任何生长因子被带入。在补充成纤维细胞OID培养物的培养基后，以上皮细胞与成纤维细胞4:1的比例加入上皮细胞。在无生长因子的GM培养基中，每隔两到三天对异位OID进行换液，持续额外培养14天。

进行免疫组织化学染色时，使用中性缓冲甲醛固定PHE，离心收集PHE并用70%乙醇替换甲醛。随后采用适用于人体组织的标准方案将其处理成石蜡包埋样本。石蜡包埋的类固醇样本可切片，并使用免疫组织化学方法进行苏木精和伊红（H&E）染色或特定分子标志物的染色。

或者，用 PBS 清洗类固醇，然后在 4% 多聚甲醛中固定。随后将样品包埋于 OCT 介质中，速冻以进行冰冻切片及免疫荧光染色，再通过流式细胞术进行分析。用 PBS 清洗类固醇，并在 37 摄氏度下通过胰蛋白酶或 Accutase 消化进行解离。

使用1毫升移液枪头反复吹打溶液，可促进类固醇完全解离成单细胞悬液。注意避免过度吹打导致细胞损伤。用等体积的培养基中和反应，并将细胞悬液通过40至70微米的细胞筛网以去除细胞团块。随后离心收集细胞，用PBS洗涤，计数后将所需数量的细胞重悬于染色缓冲液中，并根据制造商说明书进行染色。在本实验室中，我们对卵巢上皮细胞进行了部分转化，并将这些细胞与正常及衰老的卵巢成纤维细胞共培养，以模拟卵巢癌早期发展阶段。

在绝经前卵巢中，对h hert永生化正常卵巢成纤维细胞进行免疫荧光染色显示，原代正常卵巢成纤维细胞和永生化正常卵巢成纤维细胞均表达成纤维细胞特异性蛋白，但不表达细胞角蛋白7，且表达menton。在三维培养条件下单独培养的正常卵巢成纤维细胞形成PHE，呈现纺锤形形态并富含细胞外基质。在此实验中，正常卵巢成纤维细胞经七天过氧化氢处理以诱导衰老，随后与部分转化的卵巢上皮细胞共培养14天。

为了区分这两种细胞类型，对获得的类固醇进行免疫染色，以mim one作为增殖标志物，pan cytokeratin作为上皮标志物。数据分析表明，衰老的微环境会促进部分转化的上皮细胞呈现肿瘤性特征，而正常的微环境则抑制肿瘤性进展；当细胞以单层培养时无法检测到的正常细胞与恶性细胞的组织学特征，在三维培养中得以恢复。例如，当细胞转入球体培养时，透明细胞卵巢癌的组织学特征可在透明细胞卵巢癌细胞系的三维培养中被检测到，但在相同细胞的单层培养中则无法检测到。

观看本视频后，您应能充分了解如何建立三维典型培养体系，以研究上皮细胞与间质细胞在肿瘤早期发生过程中的相互作用。在建立三维培养体系时，应根据后续应用调整细胞数量，并考虑到处理过程中可能发生的材料损失。

掌握后，可按照本方案在一小时内建立3D培养体系。还可采用其他方法，如流式细胞术联合基因表达微阵列分析，以检测在3D典型培养条件下发生但在单层培养条件下无法检测到的全局性基因表达变化。这将有助于解析在3D核心培养微环境中特异性发生的双向信号通路。