利用微生物分子特征评估水力压裂对溪流的影响

本方案可用于回答水力压裂是否以及如何影响附近溪流中的细菌，进而影响溪流本身的问题。该技术的主要优势在于其整体性，因为它将引导研究人员完成从样品采集到数据分析的全部流程。演示该实验流程的将是本实验室的生物信息学家Jeremy Chansee、朱尼亚塔学院的本科生Sydney Regal，以及本实验室的实验室主管Gillian Leister。

为进行核酸提取而采集沉积物样品时，应佩戴手套，将一个带盖的无菌50毫升锥形管从岸边浸入溪流水中。在锥形管浸没于水中的状态下，打开管盖，并用管盖从水下1至3厘米深度处舀取约3毫升沉积物放入管中。采集样品后，将管中除约1毫升以外的水倒出，然后使用1,000微升移液器向样品中加入3毫升DNA/RNA保存液。

将带盖的锥形管涡旋混匀5秒，充分混合保存液与样品，并将样品置于冰上保存。返回实验室后，将样品在-20°C条件下保存用于16S DNA分析，或在-70°C条件下保存用于宏转录组RNA分析。对于滤膜采集样品，先用溪水完全充满并排空一个无菌1升瓶三次，以润洗容器，最后再将瓶子完全充满一次。

在稳定的表面上，用无菌鲁尔锁注射器吸取足量的溪水，并将该注射器连接至一个无菌且无DNA/RNA污染、直径为1.7厘米、孔径为0.22微米的聚醚砜滤膜。将溪水全部体积通过滤膜进行过滤。当整个样品体积完成同样过滤后，向注射器中吸入约20毫升空气，并推动空气通过滤膜，以去除滤膜上残留的多余水分。

接下来，使用 P1000 微量移液器吸取 2 毫升 DNA/RNA 防腐剂，在水平持握滤器的同时，将移液器枪头置于滤器筒腔内，对准滤器较大开口处加样，确保防腐剂进入滤器内部。然后用石蜡膜将滤器的每个开口紧密包裹密封，并将滤器放入盛有冰块的无菌样品袋中。采样结束后，按照所示方法将滤器储存，用于后续 16S 或宏转录组分析。

开始样品转移前，使用10%次氯酸钠和70%乙醇清洁工作区域。从沉积物样品中提取核酸时，使用经火焰和乙醇灭菌的金属工具，将约250毫克样品转移至微量离心管中。从滤膜样品中提取核酸时，使用经70%乙醇和火焰灭菌的老虎钳，在无菌表面上打开滤膜外壳，并将滤芯从外壳中取出。

使用无菌手术刀在核心样本的顶部、底部以及接缝处进行切割，并使用无菌镊子将滤纸折叠后，再用手术刀将其切成小块。然后小心地将滤纸碎片放入微量离心管中，避免接触任何未灭菌的表面。为了裂解上述任一样本中的细胞，将离心管置于细胞破碎仪中高速处理。

至少静置五分钟后，离心样品并将上清液转移至新的无菌微量离心管中。按1:1比例向上清液中加入裂解缓冲液，然后将溶液转移至提供的滤膜中。将滤膜放入新的微量离心管中，并向管中加入400 µL的预处理缓冲液。

离心后，向离心管中加入 700 微升洗涤缓冲液，再次离心滤器。弃去穿流液后，向管中加入 400 微升洗涤缓冲液进行额外一次离心，并将滤器转移至新的无菌微量离心管中。为洗脱 DNA，在室温下用 50 微升无 DNase/RNase 的水处理滤器 5 分钟。

同时，将一个 HRC 滤膜放入收集管中，并加入 600 µL HRC 提取液。离心后，将滤膜转移至新的无菌微量离心管中，并将洗脱的 DNA 加入滤膜中进行离心。流出液即为提取的 DNA。

为了构建DNA 16S RNA文库，首先使用新提取的DNA产物，采用标准PCR方案对16S核糖体RNA进行扩增。取7微升PCR产物与13微升无DNase的水混合，将PCR溶液上样至2%琼脂糖凝胶。然后以90伏电压电泳60至90分钟，检测是否存在大小为386个碱基对的条带，以确认扩增是否成功。

为了纯化DNA 16S核糖体RNA文库，将PCR产物中产生明亮条带的10微升和产生微弱条带的13微升样品汇集至一个无菌微量离心管中，并将每份混合样品约150至200纳克上样至新的2%琼脂糖凝胶的各个加样孔中。按照示范条件电泳后，从凝胶中切下386碱基对的条带，使用商业化试剂盒纯化DNA。随后用30微升10毫摩尔Tris盐酸溶液洗脱纯化的DNA，并将纯化后的文库置于干冰中保存，随后运送进行高通量测序。

在此代表性分析中，除一个样本外，其余所有提取均被视为成功。PCR 扩增后观察到的明亮条带表明 16S 方案成功。16S 样本应至少包含 1,000 条序列，理想情况下应达到至少 5,000 条序列；而宏转录组样本应至少包含 500,000 条序列，理想情况下应达到至少 200 万条序列。

展示了来自13条不同溪流的21个不同采样点的沉积物样本，用于16S和宏转录组学分析。在这些采样点中，有12个位于水力压裂活动的下游，被归类为水力压裂阳性；另外9个位于水力压裂活动的上游，或位于无水力压裂活动的流域，被归类为水力压裂阴性。通过PERMANOVA分析评估，水力压裂阳性和阴性样本数据之间的显著分离表明，水力压裂阳性样本受到了水力压裂活动的影响。

最重要的随机森林预测因子将揭示哪些特征对于正确区分样本最为关键。如果随机森林模型识别出某一分类单元具有重要性，则可将其在水力压裂阳性样本中的抗微生物耐药性谱型与水力压裂阴性样本中的谱型进行比较。若两者存在显著差异，则可能表明含有杀菌剂的压裂液已进入溪流。

微生物无处不在，因此这类工作存在显著的污染风险。最初的样品转移步骤尤其容易受到污染。如果研究者关注微生物的生物降解或其他代谢过程，可采用RNA宏基因组测序来研究微生物活跃的基因表达。

该技术可实现对原位细菌群落研究的分子技术标准化，以及对细菌序列数据的生物信息学分析。