一种用于同时定量水中粪肠球菌属（Enterococcus spp.）和人源粪便相关标记物HF183的双重数字PCR检测方法

本双重数字PCR检测方法的总体目标是同时定量水体中的一般性粪便污染和与人类相关的粪便污染。该检测方法有助于回答娱乐用水水质监测中的关键问题，例如，水体中存在多少一般性粪便指示菌（即肠球菌），以及更为重要的人类粪便相关HF183标记物的含量如何。

该检测方法的主要优势在于可在一次反应中同时定量两个靶标，并且与qPCR相比，无需进行标准曲线的测定，从而避免了相关的偏差和变异性。本实验操作将由我们的高级研究技术员Meredith Raith进行演示。开始此操作前，首先根据方案文本中的说明，使用分子级水配制所有引物的100微摩尔每升（µmol/L）储备液，并使用TEPH 8缓冲液配制探针的100微摩尔每升（µmol/L）储备液。

接下来，通过混合适量的数字PCR预混液、正向引物和反向引物、荧光探针以及无核酸酶水来配制主混合液。吸取液体并上下吹打至少10次以充分混匀，注意避免在溶液中引入气泡。由于数字PCR主混合液比常规qPCR主混合液更粘稠，因此必须采用移液吹打混匀的方法，以确保形成均一的溶液。

这有助于后续进行准确的数字PCR定量。为制备用于液滴生成的检测混合液以对样品进行双重复检测，将36 µL主混合液移入普通PCR板中。向每份36 µL主混合液中加入12 µL DNA模板，同时在板上相应位置留出对应的重复孔为空。

加入阳性对照以确保检测正常进行。加入无模板对照（NTC）以确保反应板内无污染，并为后续数据分析设定荧光基线。在使用液滴生成仪之前，使用多通道移液器将检测混合物上下吹打约15次，充分混匀。

确保移液器吸头始终浸没在液体中，以避免在混合物中产生气泡。接下来，将含有八个孔的1号卡盒插入白色卡盒支架中，并扣紧卡盒支架。此时1号卡盒已牢固就位，在生成液滴过程中不会从支架中脱落。

使用多通道移液器，轻柔地将 20 微升检测混合液转移至芯片上标记为“sample”的中间位置，注意避免引入气泡。将 70 微升液滴生成油移取至芯片上标记为“oil”的左侧位置。盖上垫圈，确保垫圈平整，并被芯片边缘的四个卡扣均匀固定。

按下液滴生成仪上亮起绿色指示灯的按钮以打开门并放入 cartridge。再次按下该按钮以关闭生成仪。门关闭后，绿色按钮将变暗，此时无法重新打开门。

液滴生成将立即开始，并持续约一分钟。在液滴生成进行期间，将第二个 cartridge 置于第二个白色 cartridge 持架中，并以与第一个 cartridge 相同的方式进行准备。当液滴生成完成后，原本昏暗的按钮将变为绿色。

打开液滴生成仪的门，取出装有1号卡盒的白色卡盒支架并放在一旁。将2号卡盒放入液滴生成仪中。取下1号卡盒上的垫圈并丢弃。

请勿松开白色的微滴卡夹，因为该操作可能会破坏新生成的微滴。使用设置为 40 µL 的多通道移液器，将吸头以 45 度角插入微滴卡上标记为“微滴”的第三列，缓慢吸取全部微滴。将微滴转移至最终的 PCR 板时，将移液器吸头抵住孔壁约一半深度处，缓慢排出微滴。

同样，当第二个芯片的液滴生成完成后，取下第二个芯片的垫圈，将生成的液滴转移至最终的 PCR 板中。在板上覆盖可穿刺的铝箔膜，并将板放入板封仪中。将封板仪温度设置为 180 摄氏度，按下封板仪的运行按钮，封板 10 秒。

开始此实验步骤时，将密封的最终PCR板放入热循环仪中。使用与最终PCR板兼容且升降温速率为每秒2摄氏度的热循环仪。运行以下热循环程序：95摄氏度预变性10分钟，随后进行40个循环，每个循环包括94摄氏度变性30秒和60摄氏度退火延伸60秒，最后在98摄氏度保持10分钟。

完成扩增循环后，将反应板转移至液滴读取仪，以自动测量每个孔中各液滴的荧光信号。在进行液滴读取前，确保液滴处于室温状态。首先打开配套软件，设置液滴读取程序。

在包含空白 96 孔板示意图的默认设置菜单中，双击 A1 孔，打开包含“样本”、“检测 1”和“检测 2”三个部分的菜单。在“样本”部分，将样本编号输入标有“名称”的文本框中，并勾选右侧标有“应用”的复选框。接着，点击标有“实验”的下拉菜单，选择“RED”（稀有事件检测），然后点击“确定”。

转至标记为“Assay 1”的部分。在“Name”区域中填写检测名称，然后按 Enter 键。在下方标有“Type”的框中，点击下拉菜单，选择“Channel 1 Unknown”，然后按 Enter 键。

转至标记为“Assay 2”的部分。在“Name”区域中填写检测名称，然后按 Enter 键。在下方标有“Type”的框中，点击下拉菜单，选择“Channel 2 Unknown”，然后按 Enter 键。

现在，A1 孔中已包含之前所有步骤的信息。为后续含有液滴的各孔命名。为节省总体设置时间，可按住 Shift 或 Ctrl 键以同时选择多个孔。当平板的数字示意图与实际平板一致时，点击菜单右下角的“确定”按钮。

在板式示意图顶部出现的新菜单中，于“模板”下选择“另存为”，并为该板命名并保存。在屏幕左侧，单击“运行”，并在弹出的“运行选项”窗口中选择合适的染料组。数据采集将随即开始，并在软件中实时显示。

当读者完成操作并出现显示“Run Complete”的对话框时，点击“OK”。检查阳性与阴性液滴之间的分离情况，确保NTC孔中所有液滴的荧光信号接近基线水平。点击标有“Events”的按钮。

在底部，单击名为 Single 的框，然后在右侧直方图的旁边，单击名为 Total 的框，以显示每个孔中被接受的液滴总数。按住控制键并单击要排除的孔，排除任何液滴数少于 10,000 的孔。单击标记为 1D Amplitude 的按钮，针对两个目标，将荧光阈值设定为 NTC 孔中阴性液滴标准差的约一倍。

在屏幕左侧“自动分析”区域下方的两个阈值按钮处，选择右侧带有实心粉红色横线穿过的图标。单击各振幅图下方“设置阈值”左侧的复选框，并输入适当的荧光阈值。随后，系统将自动计算每微升反应体系中的目标分子拷贝数浓度。

通过点击 1D 振幅界面左上角的“导出”按钮，将结果导出为 CSV 文件。在 CSV 文件中，将导出的目标浓度乘以 4，即可将其从每微升反应体系中的目标拷贝数转换为每微升 DNA 模板中的目标拷贝数。该图比较了数字 PCR 检测的双通道与单通道格式。

左侧面板和右侧面板分别显示 Enterococcus 和 HF183 的定量结果，以及对应的双重检测与单重检测结果之间的相关系数。实线表示回归线，灰色阴影表示相应的标准误差。不同类型的样品由不同的符号表示。

无论是在一个反应中同时检测肠球菌和HF183，还是在两个独立反应中分别检测，结果均高度一致且通常无法区分。数字PCR检测法对抑制物的耐受浓度比其对应的qPCR方法高出一到两个数量级。该图显示了在洁净污水DNA中添加浓度逐渐增加的腐殖酸（一种PCR抑制剂）后，HF183标志物的qPCR与数字PCR定量结果。

在无抑制剂存在的情况下，HF183 定量的预期值定义为两条水平虚线之间的 95% 置信区间。由三角形表示的数字 PCR 在腐殖酸浓度高达每微升反应体系 15 纳克时仍能提供准确的定量结果，而由十字形表示的 qPCR 在每微升 1 纳克时即开始低估目标量，并在每微升 5 纳克时完全受到抑制。观看本视频后，您应能够充分掌握如何开展该肠道 HF183 双重液滴数字 PCR 检测，或使用不同引物和探针进行其他类似的检测。

自2015年在《水研究》（water research）上发表该双重检测方法以来，我们已开发并验证了一系列其他数字PCR检测方法，这些方法针对通用粪便指示菌、微生物溯源标记物以及水源性病原体。这些检测方法可对目标物进行直接且无偏倚的定量，在水质检测领域正成为qPCR检测方法的有用替代方案。