粪便（微）RNA 提取

我们提出了一种从粪便样本中分离RNA以研究microRNA的实验方案。该方案可用于高质量和高产量地从粪便中提取RNA，并最大限度减少来自活体微生物的RNA。

需要强调的是，本实验方案中不使用结合缓冲液。本方案简单直接。首先，在2毫升微量离心管中，将25至100毫克粪便样本重悬于600微升无菌1X DPBS中。

将含有样品的离心管在室温下孵育30分钟。然后用1毫升移液器枪头充分研磨混合物，并剧烈涡旋振荡。使用匀浆器重悬混合物，设置参数为4,000转/分钟，运行1个循环，持续45秒，以优化并提高RNA的产量和质量。

向样品中加入 600 微升酸性酚-氯仿溶液，涡旋混合 60 秒。或者，为提高 RNA 产量，可使用匀浆器进行混合。在室温下以 10,000 × g 离心 15 分钟，以分离水相和有机相。

重复离心，直至界面紧凑。小心转移上层水相，避免扰动下层，至一个新的带铰链盖的 2 毫升微量离心管中。加入相当于所获水相体积 1.25 倍的 ACS 级 100% 乙醇，并涡旋振荡 3 秒。

将滤芯放入收集管中。在microRNA提取试剂盒提供的滤芯中分别加入600微升的各样品。在10,000 × g离心90秒，使混合物通过滤芯过滤。

然后弃去滤液。重复此步骤，直至全部混合物体积通过同一滤膜连续过滤。待所有样品过滤完毕后。

向同一过滤柱中加入700微升microRNA洗涤液1。离心60秒，使洗涤液通过过滤柱过滤。弃去滤液，并将过滤柱放回同一收集管中。

用700 µL在ACS级100%乙醇中配制的洗涤液2/3冲洗滤芯，然后在10,000 × g下离心1分钟。弃去滤过液，将滤芯放回同一收集管中。再用500 µL洗涤液2/3冲洗滤芯，并在10,000 × g下离心1分钟。

弃去所得的滤液，将滤芯放入同一收集管中。用 250 微升在 ACS 级 100% 乙醇中配制的洗涤液 2/3 冲洗滤芯，并在 10,000 × g 离心 1 分钟。弃去所得的滤液，将滤芯放入同一收集管中。

最后，将滤芯转移至新的收集管中，离心5分钟以去除残留液体。将滤芯转移至新的收集管，然后在滤膜中心加入50 µL无核酸酶水，并盖上管盖。室温孵育10分钟。

然后在8,000 × g离心5分钟，将RNA沉淀转移至新的收集管中。基于芯片的RNA电泳分析表明，从小鼠和人类粪便中提取的代表性RNA样品中18S和28S rRNA含量较低或缺失，且RNA片段大小主要集中在小RNA区域。进一步通过基于芯片的小RNA电泳分析显示，大部分RNA片段大小与microRNA相符。

提取的RNA纯度较高，260和280纳米波长的吸光度比值为2.0，260和230纳米波长的吸光度比值为1.8。为确保有机提取成功，务必保证各相界面清晰，仅转移上层水相，避免扰动下层相，即使这会导致水相体积减少。