高通量代谢谱分析用于微藻模型的优化

表型微阵列技术是一种高效的高通量方法，可功能性地测定细胞在多种进入代谢物作用下的代谢活性。该技术通过基于四氮唑的氧化还原染料经NADH还原后产生的显色程度来反映细胞呼吸强度，从而衡量代谢物的利用情况。在本研究中，我们将以模式物种莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）为例，介绍表型微阵列分析在微藻研究中的应用。

本研究的目的是建立一种可靠的方法，用于表征微藻的代谢表型，该方法可用于扩展现有的微藻代谢网络模型，或指导新模型的构建。莱茵衣藻CC-503菌株可从美国明尼苏达大学的莱茵衣藻资源中心获得。将细胞接种于新鲜的Tris-乙酸盐-磷酸盐-脂肪培养基中，培养至对数中期。

在显微镜下检查细胞，确保细胞状态良好且无任何污染。以2000 ×g 离心10分钟收集培养物。弃去上清液，注意不要扰动沉淀。

制备含有0.1%四氮唑紫染料的新鲜自来水培养基。加入不同抗生素（包括替门汀、氨苄青霉素和卡那霉素）以抑制细菌生长。根据每种平板类型的不同，可省略脂肪培养基及此步骤中的营养成分。将菌体沉淀重悬于新鲜自来水培养基中，调整终浓度为每毫升100万个细胞。

使用化学化合物阵列检测板，例如碳源、氮源、磷源和硫源检测板，以及肽类氮源检测板。将100 µL适量的自含培养基接种到检测板的每个孔中。确保对检测进行重复。

需要注意的是，在此阶段，应在实验前后对细胞进行革兰氏阴性染色检测，以监测细菌污染情况。将化学化合物区域实验板插入微孔板读数仪系统中。将所有板在30°C下孵育最多七天，并设置微孔板读数仪系统每15分钟读取一次染料颜色的变化。

由于大多数微孔板读数仪在孵育过程中无法提供持续光照，因此藻类应能够在无光条件下进行异养呼吸。将微孔板读数仪的原始动力学数据导出为 CSV 文件，这些文件将作为表型微阵列软件包及我们所用软件的输入数据。为进行表型微阵列数据分析，使用在 R 软件环境中运行的 OmniLog 表型微阵列分析软件包（Erik OPM）。

在 R 的图形用户界面 R studio 中，使用文中所述命令安装 OPM 软件包及其依赖项。导航至包含动力学数据 CSV 文件的目录，并使用 read OPM 函数导入数据。可使用 pref 参数估计对动力学数据进行聚合和离散化处理。

使用函数 XY 图可将呼吸作用或生长测量结果作为时间的函数，用于检测 96 孔板中的反应。可通过函数水平图将数据以热图形式可视化，从而快速比较动力学数据。下一步是鉴定与新代谢物相关的反应和基因。

如果已有藻类模型，可利用表型微阵列系统的数据分析来优化该模型。本文介绍了我们用于基于表型微阵列数据优化衣藻基因组尺度代谢网络模型的流程。当某种新化合物被检测为可利用时，将基于已知的代谢知识确定该化合物相关的反应谱，并提供相应的酶学委员会编号。

第一步是搜索 Kegg 和 MetaCyc，以确定利用化学化合物阵列中发现的代谢物所参与反应的酶分类号（EC 号）。接下来，我们以鉴定出的 EC 号为基础，在多种现有的藻类注释资源中进行搜索，例如联合基因组研究所（JGI）、Phytozome 以及同行评审的出版物。随后，将这些反应和代谢物添加到基于 COBRA 的莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）代谢网络模型 iRC1080 中，以扩展和优化该模型。

如果未发现支持该EC编号的遗传学证据，可进行基于序列谱的搜索，例如美国国家生物技术信息中心（NCBI）的位点特异性迭代搜索（Position-Specific Iterative, NCBI PSI-BLAST），以鉴定与该反应相关的候选基因。随后对结果进行人工评估。通过此质量控制步骤、且与目标EC编号相关的E值小于0.05的基因，将被添加至度量模型中。

本方案的最后一步是模型优化、评估与比较。使用最新版 COBRA 工具箱 3.0 及 MATLAB 平台执行模型优化步骤。安装 COBRA 工具箱后，即可下载 iRC1080 模型。

然后在 MATLAB 中，首先需要导航到包含参考模型 iRC1080 的文件夹。使用 Cobra 工具箱函数，将已鉴定的反应及其相关基因添加至代谢模型（如 iRC1080）中。添加反应并修改基因关联关系。

导航至包含 iRC1080 模型的目录，并执行命令以加载该模型。重命名模型，添加新的反应及其相关基因。在某些情况下，当代谢物不在细胞内生成，而是从培养基中摄取时，需要使用添加/交换反应功能，将新代谢物的转运反应加入模型中，以实现代谢物向胞外环境的输入或输出。

通过使用“在光照和黑暗条件下以生物量最大化为目标函数”的优化CB模型功能，进行通量平衡分析（FBA），测试新结果和模型（例如iBD1106）的行为表现。FBA求解结果输出三个向量：反应通量、代谢物影子价格以及反应的归约成本。此处提供一个示例，通过获取影子价格来比较iRC1080模型与其优化版本iBD1106，影子价格表示各模型中生物量目标函数对代谢物变化的敏感性。

此处展示了空白对照和CC-503菌株在碳源和氮源检测平板上的呼吸XY图和水平图，分别以青绿色和紫色表示。每个孔中的呼吸曲线反映了染料通过还原反应随时间变化的转化情况。A图中高亮的峰值代表该平板中乙酸盐作为唯一碳源被检出，这与衣藻（Chlamydomonas）相关文献报道一致。

通过比较使用三种不同方法鉴定出的代谢物数量——即经过精细整理的衣藻代谢模型 iRC1080、飞行时间气相色谱质谱法（GC-TOF）以及表型微阵列实验，结果显示，三组数据之间仅有六种代谢物重叠，而 iRC1080 与表型微阵列实验组之间则有 149 种代谢物共同存在。这表明，尽管每种技术在代谢谱分析研究中均具有各自的优势，但表型微阵列实验组可成为获取新代谢信息的重要来源。所获得的信息已被用于扩展和完善代谢网络模型 iRC1080。

在此，我们比较了iRC1080模型与扩展模型iBD1106的内容，包括反应数量、代谢物数量和基因数量。结果显示，我们的模型优化过程向新构建的网络中新增了254个以上的反应。这些反应被分类为氨基酸、二肽、三肽以及转运反应。

新鉴定的代谢物被用于扩展代谢网络，并优化现有的莱茵衣藻代谢模型。表型微阵列实验可用于表征现有菌株及新分离菌株的代谢表型。此外，我们在微藻研究中所采用的实验方案可为其他物种代谢模型的优化提供指导。