一种用于深入分析绿色藻类Chlamydomonas reinhardtii同步培养物的多组学提取方法

全系统范围的研究对于深入理解生物学功能至关重要。然而，不同组学平台需要多个独立样本，这会为数据引入较高的变异性。本方法提供了一种稳健且高通量的策略，可从模式绿藻莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）的单个样品中同时提取叶绿素、脂质、代谢物、蛋白质和淀粉。

为提取叶绿素、脂质和代谢物，将收获的衣藻细胞沉淀管置于液氮中。每管中加入1 mL 20度提取缓冲液1，重悬细胞沉淀。为避免低黏度提取缓冲液蒸发，迅速涡旋振荡各管，使细胞在提取液中充分匀浆，然后将溶液分装至2 mL微量离心管中。

在冰浴中超声处理培养物10分钟，然后在4摄氏度下以每分钟1,000转的速度于摇床中孵育60分钟。孵育结束后，加入650微升提取缓冲液二，短暂涡旋混匀样品，随后进行离心。分装各组分时，将上层MTBE脂质相500微升转移至已标记的1.5毫升离心管中。

使用 200 微升移液器去除脂相，并将 650 微升下层极性和中等极性代谢物相转移至新的已标记试管中。吸除多余体积以去除残留的下层相，并将固体沉淀物在液氮中速冻，用于 -80 度保存。对于极性代谢物的测定，将极性相的干燥沉淀物重悬于甲氧胺盐酸盐吡啶溶液中，以对羰基进行甲氧基化，并在 30 摄氏度加热样品 90 分钟。

孵育结束后，根据标准操作流程，在37摄氏度下用N-甲基-N-三氟乙酰胺对样品进行30分钟的衍生化处理。采用气相色谱-飞行时间质谱联用技术分析初级代谢物。对于非极性代谢物的测定，将非极性相的干燥沉淀物重悬于体积比为7:3的乙腈-异丙醇混合液中，然后通过离心沉淀颗粒。

然后在超高效液相色谱系统上使用反相C8色谱柱分离样品。为测定叶绿素含量，将实验样品以及方法空白的MTBE相100微升与90%甲醇900微升混合。随后在分光光度计上于655纳米和652纳米波长处测定吸光度，以区分叶绿素a与叶绿素b，并计算叶绿素a、叶绿素b含量及总叶绿素含量。

进行蛋白质提取时，将下层相沉淀物溶解于200微升蛋白缓冲液中，在室温下孵育样品30分钟。孵育结束后，离心样品并将含蛋白质的上清液转移至新离心管中。使用Bradford法测定蛋白质浓度。

为消化蛋白质，先将15微克样品在5毫摩尔二硫苏糖醇中还原30分钟，随后在避光条件下用10毫摩尔碘乙酰胺烷基化30分钟。烷基化结束后，按蛋白质与蛋白酶25:1的比例加入胰蛋白酶/Lys-C溶液，在37摄氏度孵育3小时。然后用50毫摩尔Tris HCl将样品稀释六倍，在37摄氏度继续孵育过夜。

第二天早晨，加入三氟乙酸终止消化反应，终浓度为0.5%至1%。消化完成后，在真空浓缩仪中将样品浓缩至近干，残留2至5微升溶液，过程中不加热。用上样缓冲液重新悬浮样品。使用连接纳米超高压液相色谱系统的高分辨质谱仪，通过液相色谱-串联质谱法分析肽段混合物。

为分离肽段，将四微升样品加载至一根长20厘米、内径为75微米、粒径为1.7微米的反相带电表面杂化柱上。采用部分进样环的离线模式，以等度梯度（含3%缓冲液B）维持14分钟，随后将进样环切换至在线位置并与色谱柱连接，之后在50分钟内线性增加梯度，直至缓冲液B达到20%。随着细胞在光照阶段逐渐增大，可观察到细胞体积的变化，随后在光照阶段结束时（约10小时）开始释放子代细胞。

当所有子代细胞释放后，可观察到细胞体积发生变化，因为新释放的子代细胞倾向于启动下一个细胞周期。根据本代表性实验中对极性组分进行的气相色谱-质谱分析，共注释了65种代谢物。对含脂质的中性相进行液相色谱-质谱分析，鉴定出204种不同的脂质分子，涵盖多种脂质类别。

主成分分析可用于可视化细胞周期中代谢物和脂质的整体变化趋势，代谢组学和脂质组学数据均显示出光相与暗相的分离，以及部分周期性变化阶段。此处展示了对2,463种鉴定出的富集蛋白进行功能富集分析的概览。蛋白质提取后的剩余沉淀物可用于淀粉的可重复定量分析，不同重复样本间的低标准差表明该方法具有良好的重复性。

必须避免上层叶绿素有机相干燥，因为这会影响溶剂中叶绿素的含量，进而影响样品的归一化因子。可采用多种分析方法对提取的分子物质进行生化表征。