呼吸道合胞病毒特异性核衣壳的生成与组装

该方法利用多种策略，通过一种病毒蛋白P作为分子伴侣辅助另一种病毒蛋白N，以解决重组病毒蛋白表达中的难题，从而获得不含RNA的N蛋白。在体外组装病毒特异性RNA进入核衣壳之前，即可获取无RNA的呼吸道合胞病毒（RSV）N蛋白。该方法也可应用于其他非分段的负链RNA病毒。无缝克隆技术是一种快速获得共表达载体的简便方法。而负染电子显微镜则是检测细胞粗提物中大分子组装情况的快速手段，我们在此提供两点建议：第一，在进入下一步之前，确保每一步均获得高产量且稳定可靠的结果；第二，合理设置层析程序，并练习使用镊子熟练地夹取载网。

为了构建N蛋白和P蛋白的双顺反子共表达，将四份1升的LB培养基接种大肠杆菌BL21DE3菌株，在37摄氏度下培养。当600纳米处的光密度达到0.6时，将温度降至16摄氏度。一小时后，加入0.5毫摩尔IPTG诱导蛋白表达，并过夜培养。次日早晨，通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于200毫升裂解缓冲液中。采用超声处理裂解细胞，总时长15分钟，工作3秒、间歇3秒循环进行，随后通过离心收集裂解液。将上清液上样至尺寸为2.5 × 10厘米的钴离子亲和重力柱，柱中预先装有约10毫升经5至10柱体积裂解缓冲液平衡的钴离子螯合珠，依次用5柱体积的缓冲液B和5柱体积的缓冲液C洗涤层析柱。使用2柱体积的缓冲液D从树脂中洗脱目标蛋白。同时，用5次每次1毫升的QA缓冲液对Q柱进行平衡。

使用蠕动泵将稀释后的样品加载到柱子上。将已上样的Q柱与新鲜的QA和QB缓冲液一起安装至高效液相色谱仪上。运行泵清洗程序，用一至两个柱体积的QB和QA缓冲液成功清洗仪器。

最后一次洗涤后，将流速设为每分钟1毫升，并将UV1设为280纳米，UV2设为260纳米，使用96深孔板收集各组分。然后采用逐步梯度洗脱法，每种浓度的洗脱剂使用三到四个柱体积进行洗脱，从0% QB浓度开始，每次增加5%。N0 P蛋白复合物将在15% QB缓冲液浓度下被洗脱出来。

通过凝胶过滤法分离蛋白质，使用一根1 × 30厘米的小型纯化柱，以缓冲液E进行平衡。然后通过SDS-PAGE分析含蛋白质的组分。

对于病毒特异性的核衣壳组装，将纯化的 N0P 复合物与 RNA 寡核苷酸以 1:1.5 的分子比例在室温下混合并孵育一小时。用缓冲液 E 预平衡小规模纯化凝胶过滤柱，并通过离心去除任何沉淀物。

将上清液上样至尺寸排阻色谱柱中，并比较蛋白-RNA组装样品与单独蛋白对照样品的尺寸排阻色谱图，结合核酸纯度比值，确定哪些峰对应组装的N-RNA、N0P和游离RNA。为组装N-RNA复合物，收集所有N-RNA峰对应的组分，进行RNA提取，然后运行尿素PAGE凝胶以再次确认特定RNA的长度。

为制备用于负染透射电镜的载网，使用加热板将5 mL双蒸水加热至沸腾，加入37.5毫克醋酸铀酰，得到0.75%的醋酸铀酰染色液。将该溶液转移至用铝箔覆盖的烧杯中，并加入4 µL 10 M氢氧化钠。

避光搅拌15分钟后，将溶液通过0.22微米滤膜过滤至离心管中。为使连续碳膜包被的透射电镜载网具有亲水性，将载网置于连接电源的腔室内，并对载网施加负电荷离子。剪取一条2英寸×2英寸的Parafilm膜并将其折叠。在膜的一端加入两滴40微升的去离子水，每滴40微升；在另一端加入两滴40微升的0.75%醋酸铀酰染色液，每滴40微升。向每个载网上加入3微升蛋白样品。1分钟后，用滤纸轻轻吸除多余液体，将载网在去离子水液滴中浸洗两次，随后浸入第一滴染色液中一次。然后将载网浸入第二滴染色液中30秒，再用滤纸吸去多余染色液，室温晾干后即可进行成像。

通过本方案，可获得大量可溶性的呼吸道合胞病毒N0P异源二聚体复合物。在大肠杆菌中，全长N蛋白与P蛋白的N端片段共同表达，其中N蛋白带有10×His标签。根据紫外吸收测定的核酸纯度比值，N0P包含全长N蛋白和N端P蛋白，但不含细胞RNA。

纯化的N0P随后可通过与特定RNA寡核苷酸孵育，在透射电子显微镜载网上被激活并组装成类似核衣壳的颗粒，如前所示。

纯化蛋白时，柱层析过程中应避免产生气泡，并在上样前用QA缓冲液稀释样品以调节pH值和盐浓度。操作透射电镜载网时应握住其外缘，避免污染载网。

这将有助于我们解答RSV基因组长期以来的包装问题，即其螺旋结构是左手构型还是右手构型。通过执行这些步骤，并制备真实的RNA模板，可开展RSV聚合酶活性检测，且该RSV病毒特异性核衣壳可用于高分辨率冷冻电镜分析。