细菌人工染色体：正链RNA病毒功能基因组学研究的工具

本实验的总体目标是从克隆的互补DNA（cDNA）中拯救出具有感染性的病毒颗粒，这些病毒属于基因组极性与细胞mRNA相同的正链RNA病毒，例如日本脑炎病毒。基于cDNA的反向遗传学技术是一种开创性方法，可直接对病毒基因组RNA进行操作，从而生成重组病毒，用于病毒复制和致病机制的分子与遗传学研究。该技术还提供了一个有价值的平台，可用于开发基因明确的痘苗病毒载体，以递送外源基因。

这些方法适用于克隆全长 cDNA，可用于负链或正链 RNA 病毒，尤其是基因组长度超过 10 kb 的病毒。演示该实验流程的人员包括本实验室的数位成员：研究助理尹相一（Sang-Im Yun）、博士后研究员成炳赫（Byung-Hak Song）和金珍京（Jin-Kyoung Kim），以及本科生乔丹·弗兰克（Jordan Frank）。

本出版物的视频部分涵盖了包含目的序列的细菌人工染色体的制备、从反向质粒转录合成RNA、RNA感染性的测定以及病毒产量的检测方法。在生成BAC质粒之前的所有操作步骤均在文字版实验方案中进行了详细说明。进行本实验时，首先将含有BAC质粒的E. coli DH10B单菌落接种于3毫升含氯霉素的2X YT液体培养基中。在35摄氏度、225至250 RPM振荡条件下培养10小时。

培养10小时后，扩大培养规模。随后将500微升的菌液接种到500毫升培养基中，并在剧烈振荡条件下培养6小时。6小时后，将细菌培养物分装至两个250毫升的瓶子中，在4摄氏度、3,100 ×g条件下离心15分钟。然后将每个沉淀重悬于30毫升GTE溶液中。

加入500 µL溶菌酶，将悬浮液在冰上孵育10分钟。在此期间，为下一步准备新鲜的裂解液。10分钟后，加入60 mL裂解液，轻轻旋转混匀，直至溶液变得澄清。

将反应液在室温下放置10分钟。接着，向每个瓶子中加入45毫升中和溶液，并反复倒置瓶子直至充分混匀。然后将瓶子置于冰上孵育10分钟。

通过高速冷冻离心收集中和后的裂解液，然后将上清液转移至两个新的250毫升瓶中。向每个瓶中加入0.6倍体积的100%异丙醇，并置于冰上静置20分钟。

接下来，离心沉淀，弃去上清液，并将沉淀物溶于5毫升TE缓冲液中。将两个样品合并至一个50毫升离心管中，加入等体积的5摩尔氯化锂以沉淀RNA，并将混合物置于冰上孵育10分钟。通过20分钟的低温离心收集RNA沉淀。

然后将上清液转移至一个新的250毫升离心管中，加入两倍体积的100%异丙醇，并将离心管置于冰上，以使DNA沉淀析出。20分钟后，离心沉淀，吸除上清液，将DNA沉淀物重悬于9.5毫升TE缓冲液中，并将DNA溶液转移至50毫升离心管中。

继续制备过程，使用溴化乙锭建立氯化铯梯度。用带有18号针头的注射器将混合物装入可密封的聚丙烯管中，并密封管子。将密封的管子在超速离心机中离心过夜，以形成氯化铯梯度。

第二天，从氯化铯梯度中收集BAC质粒的DNA条带。使用18号针头在梯度顶部穿刺以形成通气孔，用20号针头连接注射器从梯度侧面收集BAC DNA，然后将收集物转移至1.7毫升微量离心管中。进行洗涤操作：加入2.5倍体积的水饱和正丁醇，用普通涡旋振荡混合。

然后在室温下离心混合物，并将下层水相转移至新的1.7毫升微量离心管中。重复此洗涤步骤共六次，以彻底去除溴化乙锭。现在沉淀BAC DNA。向管中加入十分之一体积的3摩尔醋酸钠和2.5倍体积的100%乙醇。将混合物在冰上孵育10分钟。然后在室温下离心以沉淀DNA，并用1毫升70%乙醇洗涤DNA沉淀。重复一次离心并再次收集沉淀。最后，将沉淀的DNA在空气中干燥10分钟，并溶于200微升TE缓冲液中。

用 XbaI 限制性内切酶对 BAC 质粒进行大规模酶切消化，总体积为 100 微升。在 37 摄氏度下进行酶切反应，持续 12 至 15 小时。随后，在 30 摄氏度下加入额外的 25 单位绿豆芽核酸酶，继续孵育 2 小时。

孵育结束后，用蒸馏水将体积补至 300 微升。随后进行苯酚抽提：向稀释后的样品中加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇，剧烈涡旋震荡 1 分钟，离心沉淀后，将上层水相转移至新管中。

然后用氯仿重复提取。接着通过乙醇沉淀回收线性化的BAC DNA。离心收集DNA沉淀，弃去上清液，并用1毫升70%乙醇洗涤沉淀。重复离心步骤，然后将沉淀空气干燥。干燥10分钟后，将DNA沉淀溶解于30微升蒸馏水中。然后取1微升回收的BAC样品在0.8%琼脂糖凝胶上进行检测。

接下来，对线性化的BAC DNA进行25微升的截断式转录反应，反应中加入氚标记的UTP用于RNA定量。在37摄氏度条件下反应1小时，然后取1至2微升转录产物在0.6%琼脂糖凝胶上进行电泳分析。

将BHK-21细胞以每皿300万个细胞的密度接种于150毫米培养皿中，培养24小时。用预冷的A溶液冲洗细胞单层，然后通过胰蛋白酶消化法使细胞脱落。以270 ×g离心2分钟收集细胞。

然后将细胞重悬于50毫升预冷的溶液A中，并再次离心沉淀。此洗涤步骤重复进行三次。最后一次洗涤后，将细胞重悬于溶液A中，浓度为每毫升2000万个细胞。随后，在一个2毫米比色皿中，取400微升细胞悬液与2微克合成RNA混合。

立即在最佳条件下对混合物进行电穿孔，并让细胞静置10分钟。然后将细胞转移至含有600 µL完全培养基的微量离心管中。现在用1 mL体积对电穿孔后的细胞进行十倍系列稀释。取每种稀释液100 µL接种于正常BHK21细胞的单层上。孵育4至6小时后，用含FBS的MEM培养基配制的0.5%琼脂糖覆盖细胞，并继续培养4天。

将BHK21细胞进行空载电穿孔处理或使用来自两个独立克隆的全长JEV-BAC的RNA转录本进行电穿孔。四天后，用结晶紫对细胞染色以观察细胞内的感染性RNA。通过该染色方法对感染灶进行定量。接着，在转染后20小时，利用抗NS1兔抗血清和Cy3标记的二抗（呈红色）检测RNA电穿孔细胞中病毒蛋白的表达。细胞核用DAPI复染，呈蓝色。随后在转染后22小时和40小时，通过蚀斑实验检测RNA电穿孔细胞培养上清中积累的感染性病毒颗粒的产生情况。

观看本视频后，您应能够充分理解如何从克隆的正链RNA病毒（如日本脑炎病毒）的cDNA中完全拯救出具有感染性的病毒。请务必注意，操作日本脑炎病毒及其他人类病原体可能具有极高的危险性，因此在进行此类实验操作前，必须接受适当的生物安全培训。