神经元发育过程中的活性氧活细胞成像

本方案描述了在培养的斑马鱼神经元和幼体中使用过氧化氢生物传感器的方法。该方案将帮助研究人员解析活性氧在正常生理和病理生理过程中的作用。该技术的主要优势在于能够实时检测活体动物和培养细胞中的过氧化氢。

该方法可应用于其他动物，例如啮齿类动物模型系统。准备盖玻片时，使用经酸清洗并保存在100%乙醇中的盖玻片。用镊子从储存容器中取出一张盖玻片，并用火焰灼烧以去除残留的乙醇。

将盖玻片以倾斜角度置于35毫米培养皿内，完全空气干燥。制备多聚-L-赖氨酸（Poly-D-Lysine，PDL）工作液。将PDL滴加至每张盖玻片中央，避免溶液扩散至边缘，于室温孵育20至30分钟。

确保PDL不干燥。用0.5毫升无菌水清洗PDL，并让培养板完全干燥。制备层粘连蛋白工作液。

将溶液加至每张盖玻片的中央，注意避免溶液扩散至边缘。将培养板置于37摄氏度的加湿培养箱中孵育2至6小时，避免层粘连蛋白溶液干燥。为了在培养板中进行胚胎解剖以获取视网膜神经节细胞（RGCs），准备并标记四个35毫米的组织培养皿，并各加入4毫升70%乙醇。

E2 培养基一。E2 培养基二。以及解剖当天的 E2 培养基三。

将培养皿置于冰箱中。当斑马鱼胚胎发育至受精后34小时时，从培养箱中取出涂有层粘连蛋白的培养皿，并用0.5毫升1×PBS将盖玻片洗涤三次。

最后一次洗涤后，向每块培养皿中加入四毫升 ZFCM+ 培养基。避免培养皿干燥。取出预先准备并冷藏的培养皿，使其恢复至室温。

在四到六个 PCR 管中各加入 15 微升 ZFCM+ 培养基。从培养箱中取出斑马鱼胚胎，将其浸入含有 70% 乙醇的 35 毫米组织培养皿中 5–10 秒以进行消毒。使用移液器将胚胎转移至另一含有无菌 E2 培养基的培养皿中，以洗去多余的乙醇。

然后，将胚胎转移至第二个E2培养基培养皿中，用尖头镊子去除其卵膜。最后，将胚胎转移至第三个E2培养基培养皿中进行解剖。使用一对精细镊子，用其中一把镊子将胚胎固定在卵黄前方并调整其位置。

用另一把镊子移除卵黄囊后部的尾部。用镊子夹住颈部，取下头部，使脑和眼暴露于E2培养基中。用精细镊子的尖端轻轻滚动眼睛，同时用第二把镊子固定住颅部组织，将眼睛从头部剥离。

将四个眼组织转移至一个预先准备好的含有ZFCM+的离心管中，使用p20移液器轻轻上下吹打约45次以解离细胞。将含有解离细胞的ZFCM+转移至盖玻片中央。将培养物置于22摄氏度的 bench top（实验台面）上，放置在聚苯乙烯泡沫架上以吸收震动，进行培养。

成像当天，在显微镜下检查细胞，以确认视网膜神经节细胞（RGC）轴突的生长情况。进行活细胞成像时，将盖玻片从培养皿转移至活细胞成像腔室。使用配备微分干涉差（DIC）物镜、OG-590 长通红色滤光片和电子倍增CCD（EMCCD）相机的倒置显微镜。

成像前，将ZFCM+培养基更换为ZFCM-。使用10倍物镜定位细胞后，采用油浸60倍物镜并附加1.5倍放大倍率进行成像。首先采集微分干涉相差（DIC）图像。

然后使用适当的滤光片组合对 roGFP2-Orp1 进行成像。拍摄第一组图像后，更换为含有不同处理溶液的培养基。为避免 pH 值和渗透压变化，应每隔 30 分钟成像时更换一次培养基。

进行活体成像时，将受精后22至24小时的胚胎置于含0.003%苯硫脲但不含亚甲蓝的E3培养基中。每日更换培养基并移除死亡胚胎。在所需时间点，将胚胎用1%琼脂糖固定于35毫米玻璃底培养皿中进行麻醉和装载。

可根据成像感兴趣区域，将胚胎以背侧、腹侧或侧向进行定位。琼脂糖凝固后，用不含亚甲蓝但含有0.016%三卡因的E3培养基填充培养皿。设置显微镜以进行成像。

使用倒置激光扫描共聚焦显微镜对固定在琼脂糖液滴底部的胚胎进行成像。激发 roGFP2-Orp1，并使用所需的发射滤光片采集相应的图像。通过胚胎的特定区域，以五微米的切片厚度采集 z 层扫描图像。

成像后，用精细镊子将胚胎从琼脂糖中取出，置于培养箱中，在含苯硫脲且不含亚甲蓝的培养基中继续培养至所需发育阶段。此处展示的是过氧化氢生物传感器与体外培养的斑马鱼视网膜神经节细胞（RGC）延伸轴突的代表性图像。在单个神经元中，细胞体、轴突及生长锥均清晰可见。

将过氧化氢加入培养基后，比值升高，表明该系统能够检测到实时变化。过氧化氢水平的定量结果如图B所示。为了测定整条斑马鱼胚胎中的过氧化氢水平，在单细胞阶段注射了mRNA，从而使所有组织表达roGFP2-Orp1生物传感器。图中显示了斑马鱼幼鱼头部区域在两个不同时间点的图像，重点关注视网膜中的过氧化氢水平。

在受精后两天和受精后五天，测定了斑马鱼胚胎中过氧化氢的基础水平。在受精后两天，其比值显著低于受精后五天。此外，每条动物个体在视网膜过氧化氢含量的增加水平上均表现出差异。

使用精细镊子去除眼睛，并用移液管轻柔解离眼球，是本实验步骤中最关键的环节。该方案可后续结合药物处理，以研究参与活性氧信号通路的相关因子。