可注射的超分子聚合物-纳米粒子水凝胶在细胞与药物递送中的应用

本方案有助于制备可用于生物材料的聚合物-纳米颗粒水凝胶。我们希望研究人员能够进一步开发该材料，用于转化医学应用，并探索基础生物学问题。PNP水凝胶可通过小直径针头和导管轻松注射，且在注射后能迅速自愈。

这使得药物和细胞能够在长时间尺度上实现无创且可控的递送。该技术拓展了局部治疗和长效药物释放的边界，在从癌症治疗到组织再生乃至被动免疫等多种广泛疾病的治疗中具有重要意义。通过纳米沉淀法合成纳米颗粒时，将50毫克PEG-PLA聚合物加入一个8毫升的玻璃闪烁瓶中，并向瓶中加入1毫升乙腈。

涡旋振荡至完全溶解。接下来，将10毫升超纯水加入含有小型搅拌子的20毫升玻璃闪烁瓶中，并将该瓶置于搅拌台上，设置转速为600转/分钟。使用200微升移液器将1毫升聚合物溶剂溶液逐滴加入盛有水的闪烁瓶中。

当聚合物溶剂溶液迅速分散到水中时，将形成核壳型纳米颗粒。根据标准方案，通过动态光散射验证颗粒尺寸。然后将纳米颗粒溶液转移至离心过滤装置中，浓缩至体积小于250微升，并将纳米颗粒重悬于适当的缓冲液中。

制备水凝胶时，将333毫克6% HPMC-C12储备溶液加入一个1毫升鲁尔锁扣注射器中，再将500微升20%纳米颗粒储备溶液和167微升PBS加入一个8毫升小瓶中。混合后，用针头吸取稀释后的纳米颗粒溶液填充另一个1毫升鲁尔锁扣注射器，并将两个注射器连接至弯头混合器。将两种溶液混合约60个循环，直至形成均匀的不透明白色水凝胶材料。

为了测定所制备水凝胶的流变学特性，根据所选几何间隙将适量水凝胶注入锯齿状流变仪平板的中心，并采用振荡和流动测试来测量样品的力学性能。为了表征水凝胶中药物的释放行为，首先使用环氧树脂密封每根玻璃毛细管的一端。待环氧树脂固化后，使用4英寸22号皮下注射针头将100至200微升水凝胶注入每组样品至少三根毛细管中，并小心地向每份水凝胶上加入200至300微升磷酸盐缓冲液（PBS）。

根据预期的药物释放时间尺度，在适当的时间点，使用针头小心地从每个毛细管中移除 PBS，注意不要扰动水凝胶表面，并加入新鲜的 PBS 体积。研究结束后，采用适当的方法分析收集的 PBS 分样，以定量每个时间点释放的药物量。为表征凝胶包封胰岛素的热稳定性，将胰岛素和硫黄素 T 均加载到水凝胶中（方法如前所述），并使用 21 号针头将 200 µL 负载了货物分子和探针的水凝胶注入每份样品至少三个黑色 96 孔板的孔中。

然后使用光学透明的粘性板封膜密封培养板，以防止蒸发，并将培养板放入配备温度控制、振荡功能和动力学读数程序的酶标仪中。为评估水凝胶包埋细胞的活力，使用21号针头将含有适当浓度细胞的150微升水凝胶注入透明底96孔板中每个样本的三个孔内，然后向每份水凝胶中加入100微升相应的细胞培养基。在培养第一天，于每个样本组对应的时间点，将各水凝胶上的上清液更换为50微升2毫摩尔的Calcein AM溶液。

孵育30分钟后，使用共聚焦显微镜对每个孔的中心区域进行成像。为了评估包封细胞在注射前于注射器内沉降的能力，将目标细胞用PBS稀释至浓度为1×10⁶个细胞/毫升，并在室温下用50微升2毫摩尔的Calcein AM染色10分钟。孵育结束后，按所示方法将细胞与500至700微升水凝胶混合，并使用21号针头将100至200微升含细胞的水凝胶注入每个样品至少一个比色皿的底部。

随后，在接种后立即以及接种后1小时和4小时，将比色皿平放在共聚焦显微镜载物台上成像，以观察细胞是否已沉降到水凝胶中，或是否仍处于悬浮状态。可分别通过流动扫描和阶跃剪切实验观察凝胶的剪切稀化和自愈合能力。在0.1至100弧度每秒的频率范围内，在线性黏弹性区域内进行振荡剪切频率扫描实验，测定储能模量和损耗模量，可揭示该凝胶的类固相特性。

对于较硬的配方，通常在低频率下不应观察到储能模量与损耗模量的交叉现象，而较弱的水凝胶配方则可能出现模量交叉。改变PNP水凝胶的聚合物含量可直接影响载荷物质在聚合物网络中的扩散行为及其从材料中的释放速率。PNP水凝胶还可稳定对热不稳定的载荷物质，显著延长其货架期，并减少对冷链储存与运输的依赖。

整合素基序的引入有助于将 PNP 水凝胶适配于细胞治疗。包封的细胞可通过荧光标记以便于其可视化与定量分析。例如，缺乏黏附位点的配方会导致细胞活力较低，因为包封的细胞无法增殖，而含有黏附基序（如 RGD）的配方中的包封细胞则能够增殖。

我们仍在探索配方变化如何影响聚合物基质的流变学特性和动态网络结构。我们还利用荧光漂白后恢复技术（FRAP）研究分子在水凝胶内的扩散行为。这些材料可用于提出新的生物学问题，探讨持续递送可能对药物递送、疫苗开发或癌症免疫治疗产生的影响。