通过纳米沉淀法制备双嵌段聚合物纳米颗粒

本实验的总体目标是采用纳米沉淀法合成聚合物纳米颗粒。首先通过 EDC-NHS 反应制备 APLGA-PEG 共聚物，再利用该 PLGA-PEG 共聚物通过纳米沉淀法形成纳米颗粒，从而包载目标药物或 cargo。

此时，可通过动态光散射、透射电子显微镜或高效液相色谱法对纳米颗粒进行基本的生物物理表征，包括粒径、表面电荷及药物包封效率。该技术在肿瘤治疗方面具有重要意义，因为纳米颗粒能够递送难溶性抗癌药物，其疗效可能优于现有治疗方法。尽管该方法可为癌症治疗提供新的思路。

它还可用于研究其他系统，例如细胞运输。通过使用成像剂展示该技术，可将纳米颗粒与靶向配体偶联，并在体内或体外进行可视化观察。今天将有我们实验室的两名技术人员，Rohit Sukumar 和 Natalie Cummings，开始PLGA-PEG共聚物的合成：将羧基化的PLGA以5毫摩尔浓度溶于乙腈中，在温和搅拌下进行。

然后加入足量的NHS和EDC，使终浓度达到25毫摩尔，相对于PLGA而言提供五倍摩尔过量。轻轻搅拌溶液约一小时，使PLGA的羧基转化为PGA-NHS。一小时后，通过加入约10倍体积的甲醇洗涤液至溶液中，使PGA-NHS反应产物沉淀。在2000 × g条件下离心，收集P-L-G-A-N-H-S沉淀。离心后弃去上清液，以去除EDC和NHS的残留痕迹。该甲醇洗涤步骤至少重复三次。

洗涤完成后，将 P-L-G-A-N-H-S 在真空条件下干燥 30 分钟，以去除任何残留的洗涤液。随后，用与最初溶解 PLGA 时相同浓度的乙酸三乙酯重新溶解 P-L-G-A-N-H-S 沉淀。

溶解后，向 PLGA 溶液中加入异双功能 PEG，添加浓度为 5 毫摩尔/升。

24小时后，在持续搅拌下将混合溶液孵育24小时。通过加入过量甲醇沉淀PLGA-PEG嵌段共聚物反应产物。进行洗涤和离心操作，并重复额外三次，以去除所有过量未反应的PEG。

合成的最后一步是在真空条件下干燥PLGA-PEG嵌段共聚物。纳米粒子沉淀首先将PLGA-PEG嵌段共聚物和待包封药物溶解于A-P-L-G-A溶剂中。溶剂的选择至关重要，因其会影响纳米粒子的性质。然后将聚合物-药物混合物逐滴加入到3至10倍体积的搅拌水中，使最终聚合物浓度约为3毫克/毫升，需逐滴加入。

将有机溶液加入水相是形成正确尺寸纳米颗粒的关键步骤。在减压条件下继续搅拌两小时，使纳米颗粒通过自组装形成，并去除有机溶剂的残留。搅拌两小时后。

使用Amicon滤器，在2,700 × g条件下离心10分钟，浓缩纳米颗粒。随后用PBS洗涤纳米颗粒，以去除未包封的药物，并再次进行离心。最后，将纳米颗粒重新悬浮于PBS中。

基本的生物物理表征，包括粒径、表面电荷和药物包封效率，可用于更好地理解纳米颗粒的性质。纳米颗粒的储存方法可按照书面实验方案所述进行。为表征PLGA-PEG纳米颗粒，采用透射电子显微镜观察其粒径、分布及结构。纳米颗粒的粒径通常处于纳米级范围。

粒径较大且粒径分布不均可能表明偶联反应存在错误，或需要优化纳米沉淀方法。图中显示了一项药物释放动力学研究，其中采用标准HPLC定量测定了紫杉醇的载药效率和释放情况。已知固定量的纳米颗粒在固定时间间隔内进行透析。

收集透析单元中的内容物，并加入等体积的有机溶剂以溶解纳米颗粒。随后对这些样品进行高效液相色谱分析。为了定量紫杉醇含量，一旦掌握该纳米沉淀技术，可在三小时内正确完成操作。

进行此技术操作时，请始终将有机相缓慢加入水相中，以防止体系形成后产生大颗粒。该技术为纳米医学领域的癌症研究人员探索难溶性药物的应用铺平了道路，这些药物在此前因对癌症患者产生过高毒性而被认为不可行。此外，还可开展其他方法研究，例如体内药效学研究或成像研究，以回答诸如：当系统性毒性不再成为问题时，难溶性药物是否有效？靶向配体能否将纳米颗粒准确靶向至目标部位？