行为小鼠海马神经元活动观测的开颅手术操作

大家好，我叫Wang Yangdong，来自西湖大学Kiryl Piatkevich博士的分子生物工程实验室。今天我将向大家演示在活体小鼠中对海马体神经元活动进行成像的操作流程。打开焊接机并加热至所需温度。

使用辅助手具调节成像套管和注射套管的位置，如图所示。用带有针头的注射器将少量适当类型的助焊剂涂抹在成像套管与注射套管的连接处，持续五秒钟，然后移除液滴。取焊锡并将其施加至经助焊剂处理过的连接部位。

避免使用过多的焊锡，否则在手术过程中需要制作过大的颅骨开口。等待焊锡冷却，通常需要数秒钟。

通过从两个方向插入假性套管确认注射套管无堵塞。使用牙签或26号注射器针头将紫外固化光学胶涂抹在成像套管的底面。用精细镊子小心放置与成像套管相应尺寸的盖玻片。

使用标准手持式紫外灯照射，对粘合剂进行至少一小时的固化。根据IACUC批准的程序，用异氟烷麻醉小鼠。将小鼠置于立体定位仪中，并放置在手术加热垫上。

使用耳杆固定头部。轻轻向各个方向推动头部，确保头部已牢固固定。涂抹眼膏以防止动物眼睛在手术过程中变干。

使用修毛器或脱毛膏去除从颈部至眼部的毛发。在进行切口前，用碘伏和70%乙醇对术区消毒三次。去除颅骨顶部的皮肤，首先在头部基底周围做一圈水平切口，然后向吻侧方向做两个切口，几乎到达眼睑处。

然后做两个在中线处汇合的斜切口。用两根无菌棉签将结缔组织以及颈部背部的肌肉向颅骨边缘推开。在骨膜表面滴加一滴利多卡因溶液，持续两分钟，以避免过度疼痛。

用手术刀轻轻刮擦颅骨完全暴露的区域，以形成干燥且粗糙的表面。将针尖置于人字缝处，观察前后（AP）坐标是否为零，以确认头部位置是否垂直；同时观察内外（ML）坐标是否为零，以确认头部是否水平放置。若不在零点，则调节立体定位仪上的相应旋钮，直至前后（AP）和内外（ML）坐标均在0.1毫米范围内。

移动针尖以确定开颅手术的对应点，并使用细标记笔在颅骨上标记其位置。根据四个标记点以及圆圈一侧套管注射区域的轮廓，画出一个圆圈。使用气动钻，在每分钟10,000转的速度下，沿着颅骨上标记的轮廓轻轻钻孔。

钻开颅骨，直至仅剩一层极薄的骨片，通常在中心区域轻轻触碰时会开始轻微晃动。在颅骨开窗的中心滴加一滴无菌 PBS。使用尖端极细的镊子，或从相对两侧接近的两根26号针头，将骨瓣从颅骨上抬起。

使用 PBS 通过 26 号钝头针进行数次冲洗并轻柔吸液，以清洁硬脑膜表面。轻柔吸引以去除海马上方的皮层及胼胝体。皮层通常比胼胝体颜色更黄。

此外，胼胝体通常比海马体更宽。而且，从顶部观察时，胼胝体具有呈垂直和水平走向的神经纤维，非常易于区分。此处出血将影响开颅手术中脑组织的可见性。

在吸取皮层以去除血液时，应用 PBS，随后进行轻柔抽吸。如图中示意图所示，可通过白质纤维的走向辨认胼胝体。通过以环形方式施加轻柔抽吸，逐层去除胼胝体纤维。持续应用 PBS，以清除暴露脑组织表面积聚的血液。

轻柔地将植入物插入颅骨开孔中。使用L形针轻轻按压植入物顶部，使植入物的光学窗口尽可能贴近暴露的海马表面。在植入过程中，反复在植入物周围瘢痕处滴加PBS，并配合吸除操作，尽可能清除血液。

在植入物与颅骨之间涂抹一层薄薄的速干密封剂，以防止牙科水泥渗入颅骨下方。待速干密封剂固化后，将超级粘合剂均匀地涂布于颅骨表面、速干密封剂表面以及植入物表面。待超级粘合剂固化后，在超级粘合剂上方以及手术开始时所做切口周围的皮肤上涂抹义齿基托树脂。

义齿基托树脂固化后，将基台板放置在种植体周围的树脂上，并使其与成像套管对齐。在基台板周围及上方添加更多的义齿基托树脂，以固定其位置。静置数分钟使其完全固化。

避免在套管周围堆积过厚的水泥层，以确保成像窗口与物镜之间具有更好的接触。稀释义齿基托树脂以降低其黏度，从而使其能够填充使用涂布工具难以触及的空隙。轻轻将绝缘橡胶带放置在窗口上方，以保护窗口免受动物固定带可能造成的污染。

在PCR管中，将快绿染料储备液按1:9的比例加入病毒溶液中，稀释至所需滴度。吸取600纳升病毒溶液，移除假内管，插入内管，并将其连接至注射器，插入导管中。以每分钟15纳升的速度持续灌注病毒，总时长为10分钟。

保持内插管连接10分钟，以使病毒在窗膜下扩散。轻轻将内插管从导向插管中取出，并用假插管盖住。用4%异氟烷诱导小鼠数分钟。

将头部固定板连接至头夹，然后将头夹固定到跑步机上。使用低倍物镜找到最适合功能成像的滤光视野。随后切换至高倍物镜，以单细胞分辨率记录神经元活动。

进行钙成像时，使用标准GFP滤光片系统，通过商用470纳米LED激发绿色荧光。为获取荧光信号轨迹，手动分割对应神经元细胞体的感兴趣区域，并使用ImageJ软件进行分析。对于电压成像，采用40倍物镜，在近红外通道以830赫兹的采样速率进行光学电压记录。

自发性神经活动记录持续进行，最长可达25,000帧。本文介绍了一种对行为小鼠海马区作为A1区域进行长期成像的方法。该方法基于慢性植入技术。

现在，这种自制的成像窗口还可实现将病毒或药物直接靶向递送至目标神经元。我们相信，所描述的实验方案将有助于利用简单且经济的单光子成像系统，在自由活动的小鼠海马体中以高时空分辨率研究神经元活动。