冷冻保存细胞的冷冻结构光照显微镜数据采集

该方法可实现对完整生物细胞的超分辨率冷冻成像，从而精确定位细胞结构。它还可与其他成像模式联用，作为相关成像工作流程的一部分。该技术的主要优势在于，可在低温条件下利用常规荧光染料和相对较低的光照剂量快速完成超分辨率成像。

CyroSIM 是一种强大的工具，有助于深入理解细胞超微结构在内部或外部信号刺激下的动态变化。其应用包括疫苗的生产与推广、质量控制、上市后监测、抗体工程与优化，以及纳米颗粒的表征。在冷冻载台上操作样品需要一定练习，以确保载网的安全。

在开始数据采集之前，最好先熟悉 Cockpit 窗口中的各项控制功能。首先，取下冷冻载台外部杜瓦瓶的盖子，倒入过滤过的液氮，直至液位约为容器的四分之一。待初始剧烈沸腾停止后，再继续添加液氮，将容器填充至约三分之二满。

小心盖上盖子，将喷嘴朝向远离操作者的方向，以便液氮顺利排出。当液氮不再从出口流出后，将出口管置于冷冻载台的杜瓦瓶上。插入电源，连接 USB 线缆，并将外部杜瓦瓶连接至载台。

注入液氮后，按下冷冻台上的释放按钮，使其进入样品室，并等待30至45分钟，待系统冷却并稳定后再开始图像采集。使用卡带工具上的六角扳手打开样品转移卡带的两个夹板。将夹板张开至足以使载网落入两板之间的程度，但不要完全张开至最大位置。

使用长镊子将样品载网盒从液氮中取出。旋转载网盒，使其缺口与样品台内的存储位置对齐，然后将其放置在样品台上。使用适当的装置将存储盒盖打开至正确的样品位置。

使用倒置的镊子将透射电镜载网从样品 holder 中取出，浸入液氮中，确保碳膜面朝向最终将面对样品台桥架上的物镜方向，并将其放入样品转移盒中的指定位置。使用盒体工具上的六角钥匙关闭样品盒。利用盒体工具上的磁性尖端提起并安装含有载网的样品盒至样品台桥架上。

保持其浸没或靠近液氮，并确保方向正确。将包埋盒平放在桥架的定位针内，并轻轻推动以确保其固定。关闭并取出储存盒以及任何剩余的样品。

将冷冻载台盖板开口移至成像位置，并关闭样品室照明。将载台向光学系统方向滑动，使其与物镜对齐，然后使用杠杆轻轻将物镜降至指定位置，确保物镜位于冷冻载台盖板内部但不与其接触。用不透光的黑色遮光帘覆盖载台和光学系统，随后在冷冻SIM计算机上启动控制软件Cockpit。点击每台相机的读出模式按钮，并将其设置为CONV3兆赫兹。

检查每个相机的温度是否为 80 摄氏度，并确认相机风扇已关闭。打开反射相机，在透射光下选择环境光，连接 Linkam 装置，开启聚光镜，然后点击视频模式按钮。在 Mosaic 视图窗口中，缩小显示以查看网格轮廓。

如果无法看到载物台，请点击“Find Stage”，然后在圆形中心位置双击鼠标左键以居中网格。使用上下键调节样品焦距，直至网格支撑膜或任何其他相关特征清晰对焦。使用数字键盘上的“9”和“3”键来改变Z轴步进值。

当载物台居中后，关闭视频模式。在拼接视图中点击“运行拼接”（Run Mosaic），采集可见光图像的马赛克图，生成从中心向外螺旋排列的图像瓦片。点击“保存拼接图”（Save Mosaic）以保存该视图。

通过关闭环境光、聚光镜以及视频模式，然后打开所需的激发激光器，并选择对应的相机和滤光片（初始设置为50毫瓦功率和50毫秒曝光时间），来检查明场马赛克图像与之前的任何荧光图谱图像。按下“零”键拍摄图像，按下“星”键进行自动对比度调节。或者，可通过图像底部的滑块手动调整对比度。

找到具有合适荧光且生物学上有意义的细胞后，使用马赛克视图中的“标记位点”按钮标记其位置。在开始图像采集前，继续标记所有潜在位点。通过点击“将位点保存到文件”，将包含已标记位点的马赛克图像重新保存。

使用 stitchEm 软件拼接马赛克图像时，将文本格式的马赛克文件拖放到扩展名为 BAT 的 stitchEm 文件中，并将合并后的马赛克图块的 TIF 图像保存在同一文件夹中。若要保存带有标记位点的图像，请同时将马赛克文本文件和标记点文本文件拖放到图标上。根据相机视图窗口底部荧光图像中的计数和动态范围设置激光曝光时间。

选择要应用的滤光片，并针对每种激发光波长优化设置，依次单独打开各激光器。点击两台相机以将其开启。返回之前标记的位点之一，再次聚焦至目标深度。

在XY窗口的宏观载物台上，当目标区域对焦清晰后，使用上箭头键移出焦点平面，以确定Z轴层扫的顶部高度，然后点击“保存顶部”。接着使用下箭头键向下移出焦点平面，点击“保存底部”，再点击“转至中心”，并确认图像仍处于对焦状态。在控制面板窗口中选择单点实验。

从下拉列表中选择结构照明显微成像。调整堆栈高度，使其等于Z轴高度加上一微米。在上方一行中输入405纳米和488纳米激光器用于反射相机的曝光时间（单位为毫秒），在下方一行中输入561纳米和647纳米激光器用于透射相机的曝光时间（单位为毫秒）。

输入文件名，然后点击“更新”以生成一个包含日期和时间的新文件，避免覆盖之前的文件，接着点击“开始”。如果在图像采集过程中液氮杜瓦瓶正在为冷冻载台补液，请点击 Cockpit 软件中的“中止”按钮以终止该过程。在每个位置，通过关闭激光器并打开环境光和聚光镜，使用可见光采集Z轴序列图像。

在单点实验下，选择Z层扫描，并将环境光设置为20毫秒曝光，同时保持Z轴高度。对所有标记位点重复此操作。成像完成后，退出载物台并移除所有样品。

关闭样品室光源。拔下外部杜瓦瓶，并将剩余的液氮倒入另一个兼容低温的容器中，使杜瓦瓶安全恢复至常温。等待直至样品台杜瓦瓶中不再有液氮后，烘烤冷冻台的选项显示可用。

按下烘烤按钮以进入加热模式。将盖子塞入冷冻载台。冷冻SIM的分辨率明显高于标准落射荧光显微镜。

利用传统落射荧光显微镜获得的荧光图谱可用于定位成像感兴趣区域，并可从载网上的相应位置获取对应的冷冻SIM图像。一个含有U2OS细胞的样品用绿色微管细胞骨架染料和红色线粒体染料混合物染色，从而标记了细胞骨架中的微管组分和线粒体。后续成像显示了线粒体在细胞内的定位，以及微管的排列情况，突出了微管为细胞提供的结构框架及其围绕细胞器组装的细胞骨架结构。

SIM 重建过程可能产生伪影，可使用免费的 ImageJ 插件 SIMCheck 来识别这些伪影。通过 SIMCheck 生成的调制对比度图显示细胞核区域内存在调制对比度较低的区域，表明该区域更容易出现重建伪影。白色箭头指示一处重建伪影。

在执行该方案时，应始终确保样品保持浸没在液氮中或接近液氮温度，以避免脱玻璃化。同时需注意动态范围内的曝光时间和计数，因为这会影响数据质量，并防止激光对样品造成损伤。在完成冷冻成像后，同一样品可进一步采用其他成像模式进行观察，例如我们B24光束线提供的冷冻软X射线断层成像。

通过将冷冻SIM图像与包含细胞结构信息的图像相结合，我们可以进一步回答有关细胞超微结构和功能的关键问题。