使用双束扫描电子显微镜制备玻璃态生物样品薄片用于冷冻电子断层扫描

本方案概述了制备感染恶性疟原虫的红细胞玻璃态切片以进行冷冻电子断层扫描的方法。该方法能够直接观察寄生虫导致疟疾的详细结构信息。冷冻电子断层扫描可记录细胞内部的高分辨率信息。

其功能强大，足以原位观察单个蛋白质复合物，并可通过计算手段提取并进行平均化处理，从而揭示蛋白质的三维结构信息。该方案可轻松适用于不同类型的细胞，对于初次尝试制备用于冷冻电子断层扫描的玻璃态切片的研究人员而言，可作为理想的起点。这位是Alejandra Carbajal，她将负责执行今天的实验方案。

首先，使用带有CryoStage的光学显微镜检查冷冻铜网，特别注意网格上冰层的厚度梯度。在冰层较薄的区域，检查各个网格方格中的细胞覆盖情况。使用黑色永久性记号笔标记专用于Cryo-FIB-SEM的Autogrid边缘的正面及相对侧。

将切好的载网放入Cryo-FIB-SEM样品载具中，碳膜面朝上，并对细胞表面进行四纳米厚的碳或铂电子束旋转镀膜。将样品载具装入Cryo-FIB-SEM，使用五千伏的扫描电镜（SEM）评估每张载网上细胞的分布情况。在100倍低倍率下获取整体图像，以观察载网上的冰层梯度。

然后以5,000倍的高倍率拍摄图像，以观察单个网格方格。通过将气体注入系统针头插入网格上方的腔室，并将有机铂源加热至设定温度并保持一定时间，使蒸气释放，从而在每个网格表面施加一层两微米的有机铂涂层。为观察样品，倾斜样品使网格平面与离子束入射角大约成10度，并移动合适网格方格的中心，使其在扫描电镜（SEM）和聚焦离子束（FIB）图像中均可见。

使用低电流离子束，在高倍率下扫描网格，以观察位于网格方格中心的细胞。标记出两个用于铣削的矩形区域，分别位于一个三微米厚的保护区域的上方和下方。然后选择合适的束流参数，并通过调节亮度和对比度来校正像散。

设置完成后，在离子束视图中实时监测并间歇性地通过扫描电镜（SEM）观察，以300皮安的电流开始铣削。在SEM视图中检查样品，首次铣削后，若离子束尚未在保护区域上下方完全穿透样品，则通过增加矩形图案的高度来去除更多材料。当在离子束视图中观察到薄片上下表面完全光滑时，停止铣削。

逐步重复研磨过程，每次降低离子束电流，直至样品厚度达到300纳米。记录每片薄片的X Y Z位置。实验结束时，使用低倍SEM概览图像选择一组待抛光的薄片，并标记抛光起点。

标记抛光根部后，将两个矩形图案之间的间距减小至100至200纳米，并在30皮安的离子束电流下开始抛光。在2至3千伏条件下通过扫描电镜（SEM）监测进展。当扫描电镜显示薄片中的对比度消失，或有机铂涂层或薄片本身开始失去完整性时，停止抛光。

获取并保存每片薄层的低倍SEM图像。实验结束后，将样品台从显微镜中取出。取下带有薄层的载网，并将其置于液氮中保存。

小心操作载网。为了研究形态学，使用 E-64 抑制剂中的化合物二将裂殖体阻滞在逸出的不同阶段。在化合物二存在的情况下，寄生泡膜与宿主红细胞内周围血红蛋白之间的边界清晰分明。

完整的寄生泡（PV）内充满裂殖子，并聚集在单一的疟色素晶体团块中。当用E-64洗涤含有化合物二的同步裂殖体时，寄生泡膜破裂，裂殖子在红细胞内散开。铜网上细胞分布良好的典型示例显示，红细胞体积较大，边缘清晰，寄生泡膜完整。

在部分塌陷的宿主红细胞内，单个裂殖子呈现为微小的细胞簇。每个裂殖体中央均有一个黑点，指示疟色素晶体的位置。切片后，将载网放入透射电子显微镜中，以确定薄层的位置并寻找适合进行断层成像的区域。

在样本显微照片中，可见一个红细胞（RBC）刚刚被裂殖子侵入。在红细胞边界内，可观察到由宿主细胞来源的膜所包裹的裂殖子。在裂殖子的顶端，包围细胞的两层膜以及位于裂殖子顶端、与电子致密的蘑菇状结构相关的四层膜清晰可见。

在裂殖子的细胞质内，观察到裂殖子质膜与多层囊泡之间发生融合事件。在对厚度为230纳米的薄层进行的另一项透射电镜分析中，观察到经E-64处理的成熟裂殖子的典型形态。在红细胞膜内，可见裂殖子质膜及其细胞器，如内膜复合体、极环、微线体、棒状体以及核膜。

该技术最重要的部分是优化网格，以实现薄层样品的可重复且高效的制备。该技术的进一步发展将使研究人员能够观察疟原虫内的单个蛋白质分子，并确定其在疟原虫逸出过程中的作用。