样品制备与转移方案：在 Diamond Light Source 同步辐射光源 I23 光束线上进行真空内长波长晶体学实验

长波长大分子晶体学利用蛋白质和核酸中天然存在的轻原子所产生的反常散射信号。该技术用于实验求解晶体学相位问题，并确定这些元素的种类与位置。位于钻石光源（Diamond Light Source）的I23线站是一种独特的同步辐射装置，专为长达五埃波长的实验而优化设计。

它能够探测具有重要生物学意义的元素的吸收边，例如钙、钾、氯、硫和磷。由于长波长范围内的X射线会被空气显著吸收，因此这些实验需在真空环境中进行。为了在真空环境中使样品保持低温，晶体被安装在专用的、具有良好热导性的样品支架上。

将低温样品从液氮转移至真空终端站的过程与冷冻电子显微镜中使用的技术非常相似。本方案介绍了使用英国钻石光源（Diamond Light Source）开发的工具和设备将晶体转移至真空环境的操作步骤。首先将CombiPuck的盖子与底座分离，使样品支架仍附着在底座上，而小管则保留在盖子中。

将装有样品管的盖子浸入液氮中，然后将样品架和适配器连接到磁性取样棒上，收集晶体。将每个样品直接快速冷却并装入CombiPuck中，记录样品位置。使用样品盘取样棒将底座与盖子连接，以封闭样品盘。

将CombiPuck从液氮转移至干式运输罐或储存容器中。将已装有空转移块的块状插槽底座放置于泡沫容器内的支撑底座上，然后注入液氮。接着，将CombiPuck放入盛有液氮的泡沫容器中，确保插槽底座固定在泡沫容器内部的磁性固定装置上。

将所有必要工具在液氮中预冷。然后，使用载物盘分离工具的高档设置，将盖子与底座分开，使底座仍固定在磁性支架上，从而在液氮中暴露出内部的样品架。将分离棒垂直放置在样品架和适配器上方，并尽可能向下插入，确保分离棒保持垂直。

用拇指将分离器探头上的小杠杆向下推动，直至听到咔嗒声，以固定样品架，然后从适配器中拉出样品架。将分离器移至目标转移板位置上方，确保三个支脚中的一个插入转移板的中心孔中。向上拨动杠杆，释放样品架。

将样本载入下一个转移模块时，使用转盘钥匙工具将一个空的转移模块旋转至水平位置。当所有样本架转移完毕后，将盖子浸入液氮中，然后盖上模块盒以封闭模块。等待温度平衡后，将盖子完全扣合到底座上，轻轻提起，使其从转盘上脱离。

将穿梭车连接至工作站。打开氮气和空气阀门，并确保气体正常流动。然后，启动 CTS。

使用液氮冷却浴槽和转移架。将提供的漏斗放入转移架的加注口，同时在屏幕监控液位，缓慢将液氮倒入漏斗中。当指示器由红色变为蓝色时停止加注。

使用漏斗将液氮注入水浴中。利用附带的样品托盘分离工具，将一个样品托盘从液氮转移至 CTS 水浴中。取下样品托盘的盖子，并盖上 CTS 水浴的盖子。

将转移块装入转运装置时，顺时针旋转手柄90度以解锁，然后将手柄向前推进至浴槽，使手柄上的导轨确保其沿正确路径移动。待块盖冷却后，继续推进手柄，将转移块装入转运装置。要将转移块锁定在转运装置上，请将手柄顺时针旋转180度。

将手柄拉回到初始后方位置，并通过逆时针旋转90度将其锁定。在显示屏上按下“关闭穿梭阀泵”以开始抽空穿梭舱。当触摸屏上显示“穿梭舱准备就绪，可移动”和“请勿移动推杆，阀门已关闭”信息后，按下滑座下方的杠杆，并使用顶部手柄小心地将其抬起。

将样品传输舱以直立位置运送至真空终端站的气闸室并进行连接。通过触摸屏按下相应按钮，选择腔体内的空位，并将样品架移至正确的装载位置。当样品架到位后，按下“打开”按钮，启动真空联锁程序。

当序列完成后，状态变为“气闸开启”，将穿梭装置插入，顺时针旋转手柄90度以解锁推杆。轻柔地将推杆推入容器，使导轨强制推杆沿正确路径移向样品存储舱。根据屏幕上显示的视频画面，缓慢将转移块插入存储舱，并确保触摸显示屏上的块位置图标已激活。

激活后，将手柄逆时针旋转180度以释放转移块，并将推杆从容器中拉出。完全缩回后，将手柄再逆时针旋转90度以锁定推杆。按下“关闭”按钮，关闭末端站真空阀，使推杆与容器之间的空间通气至大气压。

当气闸显示状态为“OK to detach”时，取下穿梭器。将穿梭器放回 CTS 浴槽中，并按下“Open Shuttle Valve”以在装载下一个样本块之前排空穿梭器。当交通灯变为绿色且显示“OK to move rod”消息时，可将下一个转移块引入穿梭器。

为准备下一个转移块，请在浴槽内旋转样本块载具。将亚克力盖顶部的内置旋转钥匙向下推入样本块载具中心的锁孔中。在保持按压的同时，转动钥匙，使所需的转移块位于拾取位置。

所有样品块转移完成后，确保穿梭阀处于打开状态，按下触摸屏上的“Bake”按钮，选择“Bath”和“Shuttle”，然后按下“Start Bake”。位于Diamond Light Source的长波长大分子晶体学光束线I23能够接近具有重要生物学意义元素的吸收边，例如钙、钾、氯、硫和磷，从而获得增强的反常散射信号，可用于相位确定或定位这些元素在大分子中的位置。衍射数据来自一颗甜蛋白（thaumatin）单晶，波长选择为2.75 Å，是在增强的反常信号与长波长下样品吸收效应之间权衡的结果。

真空装置确保只有被样品散射的X射线到达探测器，从而在布拉格衍射峰周围提供低背景信号。该数据集产生了非常强的反常散射信号，有助于通过自动相位解析流程CRANK2解决结构问题。所得电子密度图质量很高，实现了成功的自动模型构建，甜蛋白（thaumatin）氨基酸序列的100%残基均被正确放置。

索马atin中的16个半胱氨酸残基形成了8个二硫键，这些二硫键在电子密度图中均清晰可见。由于真空长波长蛋白质晶体学是一个新兴领域，我们开发了新的样品处理工具和设备。本方案指导用户如何在Diamond Light Source的I23光束线上，安全地将样品转移至真空终端站。

真空环境为开展其他光束线无法实现的波长范围内的衍射实验提供了独特机遇。长波长X射线晶体学能够直接从天然晶体对大分子进行实验相位测定，同时也可明确鉴定与分子结合的离子。