SP0092 碳水化合物转运底物结合蛋白的生化与结构表征

本实验的总体目标是对来自肺炎链球菌的一种碳水化合物底物结合蛋白进行生化与结构表征。该方法有助于为底物结合蛋白的教学研究提供关键数据，例如缓冲液稳定性谱、寡聚状态以及原子分辨率结构的确定。本方法的优势在于能够以可靠且直接的方式提供数据，从而提高底物结合蛋白结晶及其结构解析的成功率。

首先，配制48种缓冲溶液，pH范围为4.0至9.5，氯化钠浓度范围为0至0.5摩尔。将每种溶液各40微升加入96孔板中。获取所选底物结合蛋白的纯化溶液。

向每个孔中加入5 µL SBP溶液，使其浓度达到1至2毫克/毫升。然后向每个孔中加入5 µL 20倍浓缩的荧光染料。通过反复吹打混匀溶液。

用透明粘性封板膜密封反应板。在室温下以112 ×g离心2分钟。设置实时PCR仪以每分钟3 °C的速率从4 °C升至99 °C，每步停留10秒。

将系统设置为每0.5°C采集一次荧光读数。设置荧光滤光片参数，并指定样品。

进行实验并确定具有最高熔解温度的缓冲条件。接下来，配制含有2.5%（体积分数）甘油和0.5毫摩尔浓度TCEP、且pH值与氯化钠浓度已选定的缓冲液。使用分析型尺寸排阻色谱结合多角度光散射对纯化的SBP进行表征。

确定最适合结晶的最稳定组分，并利用制备型尺寸排阻色谱（SEC）获得这些组分的纯化馏分。进行结晶前测试，以确定用于结晶的最佳蛋白质浓度。使用结晶机器人系统将所需的商业化结晶溶液分配至光学96孔坐滴板的溶液储液池中。

然后使用该系统将100纳升蛋白溶液分别加入每个结晶滴孔中。从储液池孔中转移100纳升每种结晶溶液至对应的滴孔中。用光学粘性密封膜密封板。

使用显微镜或自动成像系统，在两周内每隔一至两天评估一次晶体的形成与生长情况，之后每周评估一次。当形成足够大且形状良好的晶体后，配制一批含有额外25%（体积比）甘油的结晶溶液，作为冷冻保护剂。接着，用液氮填充泡沫杜瓦瓶。

将一个Unipuck样品容器浸入液氮中，使其冷却。然后在含有目标晶体的液滴上方切开薄膜。将0.5 µL的冷冻保护剂滴加到盖玻片上靠近液滴的位置，或在条件相同时，滴入同一条件下的空液滴腔中。

将安装在SPINE标准底座上的载晶环连接到磁性金属棒上。使用载晶环将目标晶体转移至冷冻保护剂液滴中。随后，使用载晶环将晶体从冷冻保护剂转移至浸没式单管样品盒的第一个空位中。

重复此过程以收集更多晶体。当所有目标晶体均已被装入样品腔后，使用样品托盘棒将单托盘底板放置在样品腔上。将单托盘置于液氮中运输至衍射线站。

使用冷冻镊子和样品托盘装载工具将Unipuck载入光束线样品交换杜瓦瓶，并拆卸样品封装。随后在光束线软件中选择样品，以加载并自动将样品置于x射线束中心。采集x射线荧光谱，鉴定可用于反常衍射实验的元素。

通过进行X射线吸收边能量扫描，确定收集反常衍射数据的最佳波长。随后，在标准振荡模式下以45度间隔采集三张X射线衍射图谱，以自动确定晶体的晶胞参数、对称性及衍射极限。将推荐的数据采集参数导入光束线软件，并根据需要运行单波长或多波长反常衍射实验。

通过评估底物结合蛋白SP0092在不同盐缓冲液中的稳定性，以确定最佳缓冲溶液。结果显示，在pH为6.5、氯化钠浓度介于0至0.2摩尔之间的缓冲液中，蛋白的熔解温度最高。因此，选择pH为6.5、氯化钠浓度为0.2摩尔的缓冲液用于后续实验。

通过SEC-MALS鉴定并分离了SP0092的不同寡聚化状态。在不同蛋白质浓度下对SEC谱图的分析表明，蛋白质浓度升高会触发寡聚化，提示在高浓度下较大的寡聚体更为稳定。与此一致的是，在结晶实验中，大寡聚体能够形成晶体，而单体则不能。

对天然型及硒代甲硫氨酸标记的SP0092晶体进行X射线荧光分析，结果表明两种形式的蛋白质均结合了锌。通过将入射X射线波长调节至锌或硒的X射线吸收边，使反常散射信号达到最大化。随后获得了完整的反常散射数据集，在反常信号存在的条件下，自动分析程序生成了蛋白质结构的初始电子密度图。

随后，对这些初始图谱中构建的模型进行优化和验证，以获得最终模型。观看本视频后，您应能够充分理解如何完成对底物结合蛋白或任何潜在蛋白质靶标的全面结构表征。该技术的应用前景涵盖分枝杆菌病新疗法的开发，因为它为此类蛋白质的基于结构的抑制剂设计提供了基础性见解。

这些方法也可应用于来自其他生物体的底物结合蛋白，并且可能适用于任何类型的蛋白质。