使用开源 smfBox 进行精确且准确的单分子 FRET 测量

本方案使任何人能够使用廉价、坚固且开源的仪器 smfBox 开展单分子 FRET 实验，以测量生物大分子内精确的绝对距离。单分子 FRET 技术使您能够逐个观察分子，而非数十亿分子的平均状态，从而表征它们所采取的不同构象。该方法的优势在于可用于揭示多种生物分子系统的结构与动态特性。

例如，蛋白质折叠、蛋白质与DNA的相互作用以及DNA的别构效应。在开始分析之前，启动激光控制中心，并确认已选择连续波交替恒流模式。打开两台激光器的电源。

启动 smOTTER 采集软件，并确认每台仪器均已正确配置。为校准发射光路，将一滴浸油滴加到物镜上，然后小心地将一块干净的盖玻片放置在物镜镜头上，以一定角度缓慢放下，使盖玻片与物镜之间的油层避免产生气泡。随后，在盖玻片中央加入 10 µL 浓度为 100 nmol/L 的 Cy3B 染料。

在激光占空比面板中，将供体激光设置为 0 关、45 开、55 关。将受体激光设置为 50 关、45 开、5 关。将交替激光激发（ALEX）周期设置为 100 微秒。

打开Z轴对焦选项卡。在采集面板中，将激光切换为实时模式并启动相机。调节曝光时间，使明亮的光斑位于中央，并被黑色背景包围。

从较低的 Z 位置开始，逐渐升高高度，直至光斑达到最小尺寸。然后继续升高最多 20 微米，使激光聚焦于油和盖玻片上方的样品中。当样品清晰对焦后，停止相机采集。

在Omicron控制中心，一边监测smOTTER软件对准选项卡中的y轴刻度，一边降低绿色激光功率，直至在两个探测器中均观察到信号读数，必要时调整刻度。然后拧下smfBox前端的四个螺丝，取下前面板。为对准针孔，观察对准选项卡上的信号，同时调节针孔定位器上的X旋钮，以增强绿色和红色信号。

转动 Y 调节旋钮，将针孔对准另一个方向，然后返回 X 调节旋钮，检查信号是否进一步增强。为对准针孔透镜，先沿某一方向转动透镜的 X 旋钮以降低信号，然后沿相同方向转动针孔的 X 旋钮，使信号恢复至原始水平。如果新的最大信号高于之前，则继续沿该方向迭代调节针孔和透镜的旋钮。

如果信号低于之前水平，需反复将旋钮向相反方向调节，然后使用针孔和透镜 Y 轴旋钮重复对准过程。对于雪崩光电二极管透镜的对准，从绿色雪崩光电二极管开始，调节 X 轴旋钮直至绿色信号达到最大值。随后对 Y 轴旋钮重复进行信号调节。

返回 X 旋钮，前后调节以找到信号开始下降的阈值点，将信号保持在两个阈值点中间的位置。找到 Y 旋钮的中间位置，并对红色雪崩光电二极管重复上述对准步骤。

在分析第一个样品之前，使用浸有甲醇的镜头清洁纸擦拭载物台，从一端到另一端轻轻擦拭物镜，并在物镜中心滴加三至四滴浸油。取10微升一级超纯水滴加到洁净盖玻片的中心，观察水迹以确认无荧光信号出现。然后使用橡胶头镊子小心移除盖玻片，必要时补充浸油。

为确保获得单分子数据，在稀释样品后，选择在实时轨迹面板中每秒观察到一至五个爆发事件的浓度。确定合适浓度后，将直径为8至9毫米的硅胶隔离器压在新的盖玻片中央，小心地将10微升样品加至中心位置，避免接触硅胶。然后将第二块盖玻片牢固地放置在隔离器上，直至形成密封。

检查实时的化学计量比与FRET效率直方图，以观察样品行为是否符合预期。在保存设置面板中，输入样品名称及相关信息、供体和受体标记物、缓冲液、供体和受体的激发波长、检测波长及激光功率、最终用户及用户所属单位。在采集面板中，输入实验时长（分钟），并选择合适的保存间隔，以防止出现错误时造成潜在的数据丢失。

如有需要，选择保存激光功率，然后单击“开始”以开始采集数据。在阳性结果中，每秒可获得一到五个脉冲信号。在阴性结果中，在相同时间范围内会观察到过多或过少的脉冲信号。

收集和分析完成后，交替图应与实验装置的ALEX周期相匹配。时间轨迹用于定性评估样品浓度是否合理。背景图显示了光子间延迟时间的分布情况，并对较长延迟时间部分进行线性拟合，以估算背景速率。

可通过背景轨迹来判断在实验持续时间内样品是否发生了变化。生成化学计量比与FRET效率的直方图，并分别针对所有物种及双标记物种进行筛选。通过数据的高斯拟合生成一维FRET效率直方图。

因此，样品的浓度非常关键。如果浓度过高，就不再属于单分子实验；而如果浓度过低，则需要过长时间才能获得数据。该技术实现了对动态生物大分子结构的测定，而这些结构是核磁共振（NMR）或晶体学等其他方法无法测定的。