用于可视化异染色质相关蛋白的免疫荧光染色 果蝇 唾液腺

本实验方案的目的是在果蝇细胞中可视化异染色质聚集体。为此，我们使用存在于三龄幼虫唾液腺中的多线细胞。这些细胞的基因组被扩增了近一千倍，且染色体保留了间期细胞的特征。它们具有明确的端粒，以及称为染色中心的结构，所有着丝粒在此聚集形成桥状结构，且该结构主要由异染色质组成。

利用三龄幼虫组织，还可以在不同遗传突变体背景下评估异染色质聚集体的变化。为了优化三龄幼虫的培养，首先需要收集 5 至 10 天龄的成虫，并将约 50 只（25 只雄性和 25 只雌性）放入装有标准培养基的宽口瓶中。

将瓶子置于25摄氏度的恒温培养箱中培养12小时。培养结束后，移除成虫并将其转移至新瓶子中以重复该操作。让胚胎在18摄氏度下生长22小时。

收集幼虫时，务必选择游走期幼虫，此类幼虫不具有明显的球形结构。在显微镜下，于含蛋白酶抑制剂的冰冷 PBS 中，解剖 15 对唾液腺，或在 30 分钟内尽可能多地完成解剖。将唾液腺转移至另一含有冰冻 PBS 的离心管中。

用预冷的 PBS 缓冲液（含蛋白酶抑制剂）洗涤一次。注意，每次均需等待组织沉降至管底。上一步 PBS 去除后，直接加入 0.5 毫升 1× 组蛋白固定缓冲液以及 50% 甲醇和 2% 甲醛。

在 4 °C 条件下轻轻旋转孵育两小时。用 Tris-Triton 缓冲液进行一次五分钟的旋转洗涤，加入一毫升。每次均需等待组织沉降至管底。

注意：等待组织沉降至管底。将唾液腺与上述相同的 Tris-Triton 溶液加上 1% β-巯基乙醇在 37 摄氏度下温和振荡孵育 2 小时。用 BO3 缓冲液洗涤后，再在 37 摄氏度下用含 10 毫摩尔 DTT 的 BO3 缓冲液温和振荡孵育 15 分钟。

孵育结束后，仅用一毫升 BO3 缓冲液进行一次洗涤。将唾液腺在室温下用一毫升缓冲液 B 旋转孵育两小时。移除全部缓冲液 B，加入缓冲液 A 及目标抗体。

在此情况下，我们使用铱银行提供的 HP one、A C 1 8 9。4 摄氏度下旋转孵育过夜，比例为 1:3,000。此时需注意，摇动过程不应产生气泡，以免损伤抗体。

每次使用一毫升缓冲液B，在室温下搅拌条件下进行15分钟洗涤，共洗涤15次。将腺体连同二次抗体一起转移至缓冲液B中，并置于4°C旋转孵育2小时。此步骤中，必须用铝箔纸包裹离心管，以避免二次抗体暴露于光照下。

室温下加入1毫升缓冲液B，旋转孵育，进行两次，每次15分钟的洗涤。加入Sydox或OH等DNA标记物，在1毫升缓冲液B中室温旋转孵育10分钟。用缓冲液B洗涤一次，再用PBS洗涤一次，每次洗涤均持续10分钟，并在室温下旋转。最后将唾液腺置于载玻片上，加盖盖玻片形成液滴。

将唾液腺置于液滴中央，用 Sidiflor 封片。为避免气泡变形，防止黏性液体扩散至各处。然后，用透明指甲油密封所有载玻片。

在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察。如果样品不在当天观察，则需避光保存于四摄氏度。图一展示了果蝇唾液腺中HB1单染色的代表性结果。

阳性结果为观察到一个类似A中的焦点，即异色聚集物或凝聚相。阴性结果为无信号或信号弥散。有时可观察到类似C中的双信号，即两个点，但通常数量较少。

为了分析数据，可以将其表示为柱状图，以比较不同突变背景下 HP1 的分布情况。例如，在图二中，我们可以看到在野生型中，98% 的细胞核呈现单个点的分布，而 2% 则呈现两个焦点的分布。

在突变体中，比例发生变化，出现两个焦点的比例增加至40%。图三显示了单染色条件下三甲基化赖氨酸9H3的代表性结果。在果蝇唾液腺中观察到一个焦点（B），这是在染色质聚集体或凝聚物中的理想结果；双信号或三信号（C）偶尔可见，但数量较少。在本实验方案结束时，尽管存在状态限制，您将能够观察到HP1蛋白的双色凝聚物，这将是一个良好的初步尝试。