分离小鼠主动脉瓣间质细胞以研究主动脉瓣钙化 体外

使用分离的小鼠瓣膜细胞对于研究转基因小鼠来源的基因修饰细胞中导致瓣膜钙化的信号通路至关重要。两步消化法是一种快速且高效的方法。本方案中最具挑战性的步骤是从八周龄小鼠中分离主动脉瓣。

建议使用年龄较大的小鼠进行练习，以便更清晰地观察主动脉瓣。实验开始前，使用70%乙醇清洁并消毒所有手术器械和操作区域，并将手术器械高压灭菌30分钟。初始准备工作完成后，取一只8周龄已处死的小鼠，用乙醇擦拭其胸部和腹部区域进行清洁。

使用剪刀打开小鼠的腹部和胸部，然后用小型手术剪在左心房与左心室之间进行剪切。通过灌注10毫升冷的PBS清除心脏中的血液，并剪下心脏，保留3毫米的升主动脉。在体视显微镜下，将心脏在心室中部水平剪开，并从左心室向主动脉方向剪开，从而分离主动脉瓣，然后仔细解剖主动脉瓣。

将瓣膜汇集至一个小型35毫米组织培养皿中。在75毫升细胞培养皿中，用5毫升新配制的含抗生素的10毫摩尔冷HEPES溶液洗涤分离的瓣膜，并加入5毫升I型胶原酶，在37摄氏度下持续振荡孵育30分钟。孵育结束后，将样品在150 × g条件下离心5分钟，弃上清，加入2毫升含10毫摩尔HEPES的溶液，高速涡旋振荡30秒，洗涤沉淀一次。

将离心管中的悬浮液收集到35毫米的培养皿中，用细镊子小心地将组织碎片转移至新的离心管中。随后，在15毫升离心管中加入5毫升I型胶原酶，于37摄氏度下持续振荡消化35分钟。用1毫升移液器重悬细胞以分离细胞，然后在4摄氏度下以150 × g离心5分钟。

用两毫升完全DMEM重悬分离的细胞沉淀，以150 × g在4°C下离心5分钟，重复洗涤两次。接种时，将沉淀重悬于一毫升完全培养基中，并加入六孔细胞培养板的一个孔中，加入的培养基量应尽量少。将培养板置于37°C、5% CO₂条件下静置培养。

孵育三天后，在显微镜下观察组织碎片周围是否有细胞生长，以确认细胞增殖情况。当观察到约1,000个细胞时，用经高压灭菌的镊子小心移除组织碎片，并更换培养基。当细胞融合度达到70%时，用胰蛋白酶消化细胞，并将其转移至75毫升的组织培养皿中。

开始实验前，使用70%乙醇清洁生物安全柜，并将DMEM培养基预热至37摄氏度。随后，将每种条件下100,000个细胞接种至6孔板中，加入完全DMEM培养基，并在37摄氏度下培养。24小时后，将上清液更换为成骨诱导培养基，在37摄氏度下继续培养7天，并在第3天更换培养基。

七天后，使用砷偶氮III试剂在96孔板中测定钙浓度，并在650纳米处记录吸光度。在代表性分析中，经过3至5天培养后，通过免疫荧光染色鉴定出多种瓣膜细胞表型。小鼠VIC表达波形蛋白和α-SMA，二者为瓣膜细胞的重要标志物。

此外，CD31免疫荧光染色证实VIC培养物中无内皮细胞污染。将VIC细胞在富含磷酸盐的成钙培养基中培养可诱导细胞发生钙化，进一步通过钙结节的红色阳性染色得以证实。该实验方案基于来自不同小鼠的三至五个心脏瓣膜组成的样本池。

使用同窝出生的小鼠以及三个不同的生物学重复对于验证研究结果至关重要。通过从转基因小鼠中分离细胞，利用小鼠瓣膜细胞对于理解导致主动脉瓣狭窄的分子通路具有重要意义。该方案此前已被用于研究信号通路在钙化主动脉瓣矿物质消退过程中对受体的作用机制。