利用细胞外囊泡介导的血管钙化分析 体外 和 在体 内 模型

本方案提供了一种可用于评估血管钙化的方法，并有望在未来推动针对血管钙化的治疗策略发展。血管钙化是心血管疾病最重要的预测指标。通过分离细胞外囊泡（EVs），我们能够进一步研究导致血管钙化以及血管平滑肌细胞表型转变的分子机制。该技术有助于揭示由血管平滑肌细胞介导的钙化过程中的早期分子机制。

理解这一点有助于针对已明确的机制研究相应的治疗方案。任何感兴趣的细胞外囊泡均可通过此方法进行研究，该方法并不局限于血管平滑肌细胞、成骨细胞或血管钙化研究。

处死小鼠后，用镊子提起皮肤，并沿中线做切口。去除多余的皮肤或脂肪。然后移除中线外的生殖器官、膀胱及脂肪组织。

然后将胃肠道器官移至右侧，并沿中线追踪肠道。找到后，提起中线部位，切除直至胃的整个胃肠道。通过从中线向外提起肾脏，将其切除。

尽可能贴近肾脏处切断。提起肝叶并从正中线向外侧剪开，以切除肝脏。随后使用10毫升注射器将冷的PBS注入右心室，对心脏和主动脉进行灌注。

等待肺部膨胀并变为白色。取出肺部以及多余的膈肌或肋骨。要移除骨骼，需将剪刀张开，置于小鼠尾部上方的较低区域。

向下切割，将脊柱从皮肤上剥离，并清除中线两侧的脂肪组织。皮肤完全分离后，在心脏上方紧邻处切割，切除脊柱及完整器官。若需运送至体视显微镜进行观察，将脊柱及完整器官置于盛有PBS的烧杯中，并放入装有冰块的容器内。

将脊柱和器官移入解剖皿后，用冰冷的 PBS 填充解剖皿，并用针固定脊柱和肋骨。在解剖显微镜下，用镊子小心提起心脏，从脊柱上方和主动脉下方开始剪切。持续操作直至到达脊柱底部。

从解剖皿中取出脊柱，固定心脏以及任何多余的脂肪或肌肉。从心脏下方区域开始，辨认食管、下腔静脉和主动脉。去除食管和下腔静脉，以获得清晰的主动脉视野。

使用显微解剖镊子和剪刀，开始抬起脂肪组织，并尽可能贴近主动脉进行剪切。沿中线继续操作，直至暴露全部主动脉和股动脉。在心脏处，清除所有脂肪组织，暴露主动脉弓上的三个分支。

通过将显微解剖剪插入左心室，剪除主动脉根部周围的肌肉组织，从而将主动脉根部从左心室分离。一旦主动脉被分离并清理干净，使用近红外扫描仪对主动脉成像，以观察血管钙化情况。利用定制的MATLAB脚本，对钙示踪剂的总信号进行定量分析，并将其归一化至扫描的主动脉总面积。

将 MATLAB 指向主动脉近红外扫描所得 TIF 文件的存储位置，打开各个文件，并从 TIF 文件中提取像素强度值。在彩色映射图像上，选择钙化程度最高的主动脉作为标度的最大值。当窗口中出现命令“图像中有多少个样本”时，输入当前图像中主动脉的数量，并逐一选择每个主动脉。

选定主动脉后，MATLAB 将生成二值图像，分别标记主动脉的总面积和钙化区域。通过这些掩膜图像的数据，可计算出钙化区域的总面积、主动脉的总面积、钙化阳性区域所占百分比以及钙化区域的平均强度。在对主动脉扫描完成后，立即合并两到三根主动脉样本，以获得足够的蛋白浓度。

将2至3个合并的主动脉置于1.5毫升消化液中，在37摄氏度下孵育2小时。收集消化液，于1,000 g离心15分钟以去除细胞碎片。接着，为去除微囊泡，将上清液在33,000 g再次离心30分钟。

收集上清液并评估其钙化潜能。将收集的条件培养基通过离心去除细胞碎片后，再将收集的上清液在 33,000 g 离心 30 分钟。收集上清液并转移至新管中。

然后向细胞外囊泡样品中加入1%的300毫摩尔磷酸二氢钠溶液，并用移液器吹打混匀。将200微升混合液转移至96孔板中，将96孔板放入酶标仪，在37°C下孵育。设置酶标仪每1分钟记录一次在340纳米波长处的吸光度。

将300微升胶原蛋白溶液加入八孔玻璃培养板的每个孔中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育72小时。孵育结束后，向孔中加入300微升DMEM作为对照。向其余孔中加入先前收集的300微升细胞外囊泡培养基样品，并按照之前的方法孵育六天。

第10天，将2.5微升OsteoSense与DMEM混合液用移液器加入每个孔中，孵育24小时。孵育结束后，使用倒置显微镜，通过盖玻片培养皿底部的OsteoSense荧光滤光片对水凝胶成像，或使用长工作距离物镜从顶部成像。利用ImageJ中可用的颗粒分析功能，对所采集图像中的钙化数量和钙化大小进行评估。

然后导航至图像，选择调整，点击阈值以对图像进行二值化处理，使得只有OsteoSense信号呈现白色。接着使用分析功能，点击分析颗粒命令，以获取图像中每个钙化区域的信息。为保持一致性，每个图像的分析应使用相同的阈值参数。

近红外光学扫描成像显示，慢性肾病小鼠主动脉的OsteoSense信号强度在整个主动脉中均高于对照组小鼠的两条主动脉。在促钙化培养基中培养的血管平滑肌细胞所获得的条件培养基，在340纳米处的吸光度高于对照培养基。与对照样品相比，促钙化样品的吸光度增加速度快1.5倍。

在促钙化条件下培养的细胞，其条件培养基中含有矿物质沉积物。在显微解剖主动脉时，需仔细切除主动脉周围脂肪组织。应尽可能保留更多的主动脉组织用于分析，但该过程可能较为繁琐。

外泌体分离后，可进行其他检测，例如碱性磷酸酶活性测定或免疫印迹分析。这些检测可进一步揭示外泌体中存在的机制和蛋白质。