一种测定谷物和豆类中游离可溶性酚酸组成及抗氧化能力的通用方法

一种测定谷物和豆类中游离可溶性酚酸组成及抗氧化能力的通用方法。全谷物，包括谷类和豆类，是人类膳食的重要组成部分。其对人类的营养重要性早已被认识。

然而，最近有报道称，它们具有抗氧化保护作用，对健康有益。谷物外层和豆类种皮中含有的酚酸有助于全谷物的抗氧化特性。这些酚酸能够清除对生物大分子造成氧化损伤的自由基。

全谷物中发现的两类酚酸为羟基苯甲酸和羟基肉桂酸。本研究提供了一种提取全谷物酚酸并测定其体外抗氧化能力的简单方法。本研究使用五种全谷物样品：硬粒小麦、黄玉米、黑眼豇豆、大豆和红芸豆。

将100毫克全麦面粉样品直接准确称量至一个2毫升容量的棕色微量离心管中。管子的深色有助于防止混合物暴露于光线下。向每个含有样品的管中加入1毫升80%的水-甲醇溶液。

涡旋混匀甲醇溶液与样品。将样品超声处理60分钟，以提取游离可溶性酚类化合物。超声过程中用盖子覆盖样品，以提供额外的避光保护。

超声处理后，将混合物在20,000 × g条件下离心5分钟，使固体残渣沉淀，上清液位于上层。离心后，游离酚类化合物存在于上清液中。在注入HPLC仪器前，需将上清液过滤。

过滤上清液时，取下3 mL注射器的活塞，并安装一个注射器滤器。滤器的孔径不应大于0.22微米。用移液器将约0.4毫升的上清液加入注射器顶部。

重新插入推杆，将液体通过滤膜推入含有小瓶插件的高效液相色谱小瓶中。在仪器已设置为运行手稿中所述的高效液相色谱分析方法后，将小瓶按样品列表顺序装入自动进样盘。在320纳米和280纳米波长下获取高效液相色谱图，图中应显示代表不同酚类化合物的明显色谱峰。

使用适当的标准曲线，在320纳米波长处定量羟基肉桂酸，因为它们在此波长下具有最大吸收峰。依据相同原理，在280纳米波长处定量羟基苯甲酸。采用Trolox（一种水溶性维生素E类似物）作为标准品，以评估全谷物提取物的体外抗氧化能力。

准确称取1毫克Trolox至一个Falcon管中。加入4毫升50%的水-甲醇溶液溶解，配制成1毫摩尔/升（即1000微摩尔/升）的储备液。配制6个浓度的Trolox溶液，分别为50、100、200、400、600和800微摩尔/升，用于绘制标准曲线，以评估DPPH自由基清除能力和Trolox当量抗氧化能力（TEAC）。

同样，配制用于评估氧自由基吸收能力（ORAC）的 6.25、12.5、25 和 50 微摩尔/升的 Trolox 溶液。每种浓度的总体积定容至 500 微升，如表一所示。在分析前，用甲醇稀释样品提取物。

此处，将黄玉米和豇豆提取物稀释2倍，小麦和芸豆提取物稀释5倍，大豆提取物用甲醇稀释10倍。称取8.23毫克ABTS，加入洁净的、容量为2毫升的棕色微量离心管中。

接下来，将1.62毫克过硫酸钾称量至一个洁净的、容量为2毫升的棕色微量离心管中。通过涡旋振荡使每种称量好的化学物质溶于1毫升蒸馏水中。由此得到16毫摩尔的ABTS溶液和6毫摩尔的过硫酸钾溶液。

通过等体积混合ABTS溶液和过硫酸钾溶液来配制ABTS储备液。溶液会立即变为深色。将此混合液置于避光条件下孵育12至16小时。

将ABTS储备液用200毫摩尔磷酸盐缓冲液稀释30倍，制备ABTS工作液。具体操作为：向2毫升ABTS储备液中加入58毫升200毫摩尔PBS。所得工作液含有0.27毫摩尔ABTS和0.1毫摩尔过硫酸钾。

进行分析时，取10微升每种稀释后的提取物加入96孔微孔板中。向每个孔中加入190微升ABTS工作液，孵育60分钟。使用微孔板读板仪在750纳米处测定反应混合物的吸光度。

使用浓度范围为 100 至 800 微摩尔每升的 Trolox 标准品绘制校准曲线。DPPH 抗氧化能力测定需要一种自由基生成化合物 DPPH。称取 1.2 毫克 DPPH 至一个空的 15 毫升离心管中。

将DPPH溶解于甲醇中，配制60微摩尔的溶液。DPPH实验用于检测样品提取物清除DPPH产生的自由基的能力。向微孔板孔中加入5微升样品提取物。

接下来，加入195微升60微摩尔的DPPH甲醇溶液，孵育60分钟。在515纳米处测定吸光度。使用Trolox标准品绘制标准曲线。

图一显示了在全谷物中发现的羟基苯甲酸的结构。在本研究中，香草酸是唯一鉴定出的羟基苯甲酸。图二显示了在全谷物中发现的羟基肉桂酸的结构。

本研究中，在样品中鉴定出对香豆酸、咖啡酸和阿魏酸。表二显示了在样品中鉴定出的酚酸。如前所述，香草酸是样品中唯一鉴定出的羟基苯甲酸。

该物质仅在豇豆提取物中被检出。羟基肉桂酸中的咖啡酸仅在肾豆中被检出，而对香豆酸则在黄玉米、豇豆和大豆中被检出。阿魏酸在所有样品中均被检出，且是样品中主要的酚酸。

酚酸总浓度从高到低依次为大豆、豇豆、黄玉米和芸豆，或含量相当，随后为小麦。表三显示了各样品的总酚含量和抗氧化能力。抗氧化能力包括DPPH自由基清除能力、TEAC、ORAC以及样品的总抗氧化能力。

总抗氧化能力是 DPPH、TEAC 和 ORAC 值的总和。与表二类似，大豆的总抗氧化能力最高。然而，与总酚酸含量排名第二的豇豆不同，总抗氧化能力排名第二的是芸豆。

这种异常现象与单个酚酸的结构以及香草酸（一种羟基苯甲酸）对豇豆中羟基肉桂酸抗氧化作用的可能拮抗效应有关。本研究得出结论：不同全谷物的酚酸组成存在差异。在所研究的全谷物中，大豆的酚酸总量最高，相应地，其抗氧化能力也最强。