利用注射器和针头模拟血流动力学应力对循环肿瘤细胞的影响

本方案通过短暂的流体剪切应力处理悬浮状态的癌细胞，以模拟转移性癌细胞在循环系统中所受血流动力学力的某些方面。该技术相对简单，可施加短暂的高强度流体剪切应力。在实施本方案时，需注意未封帽的针头，切勿弯折，以免改变施加的剪切力。

该操作可能产生气溶胶，因此需采取适当的安全防护措施。首先，吸除培养基，用五毫升不含钙和镁的 PBS 洗涤 10 厘米培养皿，使 PC3 细胞从培养皿上脱落，此时细胞融合度应达到 70% 至 90%。随后吸除 PBS，加入一毫升 0.25% 胰蛋白酶。

胰蛋白酶消化后，在倒置显微镜下观察细胞脱落情况。为终止胰蛋白酶作用，加入5 mL含10% FBS的DMEM/F12培养基。随后，将细胞悬液转移至锥形管中，测定细胞浓度及总细胞数量。

将细胞悬液在300 × g离心3分钟，然后吸除上清液，并将沉淀重悬于无血清的组织培养基中。在14毫升聚苯乙烯管的7毫升刻度线处剪去管底，将混合的细胞悬液加入该剪切过的管中。在施加流体剪切应力前，单独收集细胞的静态对照样品，用于后续检测分析。

为了使剩余的细胞悬液样品暴露于流体剪切应力，将细胞悬液吸入一支5毫升注射器中，并连接一个30号半英寸针头。将装有未加盖针头的注射器固定在注射泵上，设置流速以达到所需的流体剪切应力水平。启动注射泵，并以约45度角将剪切后的样品收集到已切割的试管中，以减少泡沫产生。

小心地将注射器从注射泵上取下，并使用钳子取下针头，注意不要触碰针头。重复该操作，直至细胞悬液经受了所需次数的流体剪切应力脉冲。在将细胞暴露于流体剪切应力之前，先对静态样本进行活力检测。

进行酶学检测时，将静态样品各100微升等份重复转移至96孔板中。随后，收集经流体剪切应力处理后的样品各100微升，并置于96孔板中。向每个样品孔以及含有100微升单独培养基的孔中加入20微升浓度为0.15毫克/毫升的刃天青溶液。

将培养板置于37摄氏度的组织培养孵育箱中孵育两小时，然后使用酶标仪检测荧光和吸光度，并通过将各流体剪切应力处理样本的平均信号与静态对照样本的平均信号进行比较，计算活细胞百分比。同样，从静态样本中收集等分试样，用于进行流式细胞术和克隆形成实验，具体操作如文本稿件中所述。在代表性分析中，通过将同源活检来源的乳腺上皮癌细胞暴露于多种流体剪切应力脉冲后，采用刃天青还原法评估其存活率。

尽管每种细胞系表现出不同的耐药特征，但在经历10次流体剪切应力暴露后，其存活率无显著差异。来自不同组织来源的其他癌细胞系在经历10次流体剪切应力后均表现出超过20%的存活率，唯有MIA PaCa-2细胞因对流体剪切应力引起的机械破坏较为敏感，其存活率低于10%。在施加流体剪切应力之前采集静态样本时，应确保细胞悬液充分混匀，呈均一状态。

使用镊子小心地取下针头，切勿弯曲或触碰针头。除了检测细胞活力外，还可以评估基因表达、细胞信号传导、增殖和迁移的变化。以此作为流体剪切应力暴露的模型，可以研究癌细胞抵抗流体剪切应力破坏的机制，同时评估流体剪切应力对癌细胞生物学特性的影响。

本实验室及其他研究团队已采用该技术来探究流体剪切应力对循环肿瘤细胞的影响。这些研究表明，流体剪切应力会迅速改变癌细胞的力学特性，而这种改变有助于癌细胞抵抗流体剪切应力造成的破坏。