对Langendorff法的改良以实现从成年小鼠中同时分离心房和心室心肌细胞

该方案有助于提高灌流小鼠心脏中心房组织的收获率。此方法的主要优势在于，心房和心室心肌细胞可在相同的消化条件下同时被分离。该方法可为在细胞及亚细胞水平上研究心脏疾病的机制提供重要信息。

处死一只8至10周龄的雄性C57黑六小鼠后，使用组织镊提起剑突处的皮肤。然后用组织剪在皮肤上做一个小的侧向切口。在皮肤与筋膜之间进行钝性分离。

在两侧以 V 形将皮肤切口向腋窝方向延伸，并继续切开肋骨。然后使用组织镊夹住胸骨，将肋骨向上掀开，充分暴露心脏和肺。使用弯镊剥离心包膜。

如果胸腺覆盖大血管，使用两把弯镊向两侧撕开胸腺，然后轻轻将心脏基部向尾侧牵拉，直至主动脉及其分支动脉呈现为Y形血管结构。在左颈总动脉处横断主动脉，随后切断无名动脉。切除心脏并立即浸入含有台氏液的培养皿中，以冲洗并排出残留血液。

然后将心脏转移至另一个含有溶液一的培养皿中。在体视显微镜下，使用精细的虹膜剪去除任何多余的组织。排出注射器中的气泡。

然后借助两把直血管钳，进行逆行主动脉插管，注意整个插管过程均需在液面下完成。调整插管深度，使导管尖端位于升主动脉内，注意避免穿透主动脉瓣。随后使用预先打结的3-0缝线，将主动脉结扎固定于导管的卡槽处。

用注射器缓慢注入溶液一，以冲洗残留的血液。然后将插管的心脏连接至兰格多夫装置，注意避免将任何气泡引入心脏。连接插管心脏与兰格多夫装置后，用溶液一灌注心脏约两分钟。

使用一次性无菌聚乙烯移液管吸取约 2.5 毫升溶液三，并将其置于水浴中预热以备后续使用。随后，用剩余的溶液三灌注心脏，以消化组织，持续约 11 至 12 分钟。在使用溶液三灌注的前两分钟后，通过蠕动泵将灌注液循环回灌注液储液器中重复利用，直至消化完成。

当心脏肿胀、颜色略显苍白且变得松软时，使用有齿镊轻轻夹住心肌。若可见压痕，则终止消化，并将心脏从装置上取下。为分离动脉和心室肌细胞，用镊子将心室和心房取出，并分别置于不同的培养皿中。

然后将预热的溶液三加入两个培养皿中。用钝头镊子将组织研磨至浑浊状态，再轻轻吹打组织以实现均匀消化，避免引入气泡。为终止残留的酶活性，用移液器将浑浊的消化后组织转移至溶液四中，然后在192 × g 条件下离心20秒。去除上清液后，将细胞沉淀重悬于溶液五中。

为避免钙反常和钙超载，需逐步重新引入钙离子，即通过逐渐加入总共50微升、浓度为100毫摩尔/升的氯化钙溶液至细胞悬液中。待全部氯化钙加入后，将细胞保存于台氏液中，用于后续膜片钳实验。灌流插管的深度与心房及其附属结构的灌流效果相关。

当导管尖端位于升主动脉时，两个心耳均膨胀，表明心房灌注充分。然而，当导管尖端位于主动脉根部时，两个心耳均萎缩，表明灌注不足。通过在升主动脉处插管分离的心房肌细胞，无论是在钙离子重新引入之前还是之后，其存活率均高于在主动脉根部插管分离的心房肌细胞。

相比之下，通过升主动脉或主动脉根部插管分离的心室肌细胞，在钙离子重新引入前后，其存活率均无差异。对分离得到的心房和心室肌细胞进行全细胞膜片钳记录钠电流，并分析电流密度，结果证实分离细胞的质量符合电生理实验的要求。在横断主动脉时，应确保保留足够的组织用于结扎。

否则，结扎后导管可能会穿透主动脉瓣。