细菌中的RIBO-seq：用于高通量测序的样品收集与文库构建方案

核糖体谱分析技术，也称为RIBO-seq，目前是研究体内蛋白质合成过程最有效的工具。该方法的优势在于能够通过精确定位核糖体的位置和数量来监测翻译过程。RIBO-seq基于以下原理：核糖体结合到mRNA分子上后，在核酸酶消化过程中可保护其覆盖的转录本片段不被降解。

所获得的片段称为核糖体印迹（ribosomal footprints），可进行测序并比对至其来源的转录本，从而确定核糖体的精确位置。在进行RIBO-seq的同时，还需进行高通量的总mRNA测序，以提供参考基准，并在数据分析过程中实现RIBO-seq与RNA-seq数据的比较。在收集细胞前，可选择性地向细菌培养物中添加氯霉素，使其终浓度为每毫升100微克，以抑制翻译过程。

将培养物与抗生素孵育一分钟。如果收获时间长于常规时间，此步骤非常重要，因为抑制翻译过程可以延长样品收集时间。使用预热的过滤系统收集样品。

可通过引入振荡以模拟生长条件。当所有培养基都通过滤膜后，停止过滤，但不要让滤膜完全干燥。使用预先温育并消毒的刮勺，快速将细胞从滤膜上刮下，收集细菌沉淀物。

立即将带有收获细胞的整个刮勺放入装有液氮的50毫升离心管中。收获的细胞沉淀应完全浸没在液氮中。待沉淀彻底冻结后，使用预先冷却的刮勺将冻结的细胞刮下。

盖上盖子，并确保其已穿孔。这一点非常重要，因为液氮在蒸发时会因压力变化导致密闭容器爆炸。准备好GMPP、DNA拭子以及专用于溶菌酶的全新Eppendorf管。

根据需要，在裂解缓冲液中加入氯霉素。将500 µL裂解缓冲液分别加入各离心管中，每管对应一个样本，并置于冰上。使用实验室消毒剂和70%乙醇对研钵和研杵进行去污染处理。

通过将液氮倒入研钵中来冷却研钵和研杵。将冻存的细菌沉淀转移至预冷的研钵中，研磨成粉末。加入约等体积的氧化铝并继续研磨。

根据需要倒入液氮，保持研钵、研杵和细胞处于低温状态，防止研钵内物质解冻。使用前立即向裂解缓冲液分装液中加入GMPPNP和DNA拭子。将溶液转移至研钵中，继续研磨。

在研磨的同时让溶菌酶缓慢融化。当溶菌酶完全融化后，将混合物转移至预冷的Eppendorf管中，并放回冰上。在4°C条件下，以20,000 × g离心溶菌酶五分钟。

将上清液转移至新的预冷的Eppendorf管中，并置于冰上。使用NanoDrop测定每个稀释样品的RNA浓度。将每份裂解物分为两部分，其中0.5至1毫克RNA用于RIBO-seq，其余部分用于RNA-seq。

向1毫克RNA中加入3.8微升Tris pH 8缓冲液中的MNase，并用裂解缓冲液补至总体积为500微升。在25摄氏度、300转/分钟条件下孵育45分钟。孵育结束后，使用 commercially available RNA纯化试剂盒对样品进行纯化。

配制含8摩尔尿素的15%聚丙烯酰胺TBE凝胶，并将其置于含有TBE缓冲液的电泳槽中。以200伏恒定电压预电泳至少10分钟。将样品与TBE-尿素上样缓冲液混合。

在 95 摄氏度下变性 1 分钟，然后立即置于冰上。使用注射器将 TBE 缓冲液注入凝胶孔中以洗去尿素。上样时，每个样品之间至少留出一个孔的空间，以分离各样品并防止交叉污染。

使用长度为29个核苷酸的寡核苷酸，以及长度为26和32个核苷酸的寡核苷酸混合物作为标记物。以180伏恒定电压进行电泳。配制无菌缓冲液用于过夜孵育。

电泳结束后，用SYBR Gold染色凝胶。使用无菌针头或剃刀片切取长度在26至32个核苷酸之间的凝胶条带，并将凝胶片段分别放入不同的Eppendorf管中。在处理不同样品之间应更换针头或剃刀片。

向每个离心管中加入200微升过夜孵育缓冲液，在10摄氏度、1000转/分钟的条件下过夜孵育样品。第二天，使用RNA纯化试剂盒清洗样品，并用18微升无核酸酶水洗脱。所得核糖体足迹产物即可用于文库构建。

使用市售试剂盒对用于RNA测序的样品进行核糖体RNA耗竭。接着，使用RNA纯化试剂盒对样品进行纯化。进行碱性水解操作如下：配制碱性水解缓冲液，将一倍体积的缓冲液加入一倍体积的样品中，在95 °C下孵育25分钟。

向每个样品中加入5微升3摩尔的乙酸钠（pH 5.5），以终止反应。使用RNA纯化试剂盒对样品进行纯化，并用18微升无核酸酶的水洗脱。所得的随机片段化RNA即可用于文库构建。

每个样品中加入10 µL的10×反应缓冲液和5 µL的T4多核苷酸激酶。37 °C孵育1.5小时。孵育结束后，向每个样品中加入3 µL的1 mM ATP，并在37 °C继续孵育1小时。

接下来，使用RNA纯化试剂盒对样品进行纯化。根据此处提供的方案，使用 commercially-available 试剂盒进行文库构建。使用6%聚丙烯酰胺凝胶进行PAGE电泳。

用SYBR Gold染色凝胶。切下含有文库的凝胶片段。对于RNA-seq样本，文库大小为135至180个核苷酸；对于RIBO-seq样本，文库大小为135至170个核苷酸。

使用无菌的针头或剃刀将切下的凝胶片段放入不同的Eppendorf管中。注意在处理不同样品之间更换针头或剃刀。向每个切下的凝胶片段中加入100 µL无核酸酶的水。

在10°C、450转/分钟条件下过夜孵育。第二天，使用DNA纯化试剂盒对样品进行清洗。所获得的文库可直接用于高灵敏度的DNA芯片电泳进行质控和定量，并随后进行下一代测序。

通过高灵敏度的芯片上DNA电泳验证，所获得的cDNA文库具有适用于下一代测序的适当数量和质量。与RNA-seq文库相比，代表RIBO-seq文库的条带和峰形更窄且更清晰。根据芯片上电泳结果，这些文库具有预期的片段分布特征。

RIBO-seq文库中靠近200个碱基对位置出现的额外峰可能代表休眠的核糖体、未完全消化的核糖体足迹或人为假象（例如rRNA），在生物信息学分析过程中，当对测序获得的数据进行修剪并过滤rRNA和tRNA时，这些峰可被舍弃。文库构建过程中生成的cDNA平均产量为32纳克，足以满足下一代测序所需的材料量。通过芯片电泳进行质量控制后，文库被用于在Illumina NextSeq 500平台上进行单端50碱基对的测序。

去除接头序列和低质量序列后，RNA-seq 样本每个样本获得 2500 万至 4700 万条读段，RIBO-seq 样本每个样本获得 2500 万至 5000 万条读段。所获得的数据使用 FastQC 进行了质量控制检查，RNA-seq 和 RIBO-seq 样本均表现出非常好的质量。

根据所述方案制备的文库经测序后，RNA-seq 样本每个样品获得 240 万至 960 万条唯一比对的读段，RIBO-seq 样本每个样品获得 230 万至 1040 万条唯一比对的读段。RIBO-seq 数据表现出三联体周期性以及高而窄的峰，对应于起始核糖体，符合核糖体足迹的特征，而该特征在 RNA-seq 数据中未观察到。此外，核糖体足迹和 mRNA 片段在编码序列上平均覆盖度分布图显示，与预期一致，RIBO-seq 数据集中比对到编码区（CDS）的读段比例更高。

映射的核糖体足迹可视化结果显示，其模式与按照标准RIBO-seq流程（包括通过蔗糖梯度超速离心回收单体核糖体）进行的相同实验所获得的结果非常相似。我们的方案已用于在多种生长条件下研究翻译调控，也可应用于翻译其他方面的研究，例如翻译起始位点的检测以及新蛋白质编码基因的发现。按照本指南制备文库并进行测序，可获得足够数据用于全面的生物信息学分析。

我们在此介绍的方案快速、简便且成本低廉，可使用标准实验室设备完成。