基于质谱的RNA结合区域鉴定的样品制备

本实验的总体目标是在活细胞中鉴定RNA结合蛋白，并利用紫外光介导的光交联结合质谱技术，绘制这些蛋白的RNA结合区域。该方法有助于回答表观遗传学领域中的关键问题，例如哪些表观遗传调控因子与RNA结合，以及介导这些相互作用所需的蛋白质区域是什么。该技术的主要优势在于无需纯化蛋白质-RNA复合物，因此所需样品量极少，并可鉴定与任意类型RNA结合的蛋白质。

如文中所述，该方法主要针对核蛋白，因为这是我们的科学兴趣所在；但通过在分级分离步骤中进行少量修改，也可用于研究其他亚细胞结构中的RNA及其结合蛋白。根据文本方案培养并扩增小鼠胚胎干细胞（ESCs）后，将细胞扩增至所需数量的10厘米培养皿。在培养皿达到汇合前，直接向培养基中加入四种SU，使其终浓度为500微摩尔（µM）。

将4sU对照组培养皿保持未处理状态。轻轻摇动培养板，使4sU在培养基中均匀分布，然后将培养板放回相同的组织培养孵育箱中孵育两小时。4sU的掺入效率因细胞类型而异，因此可能需要优化其浓度和孵育时间，以确保高效的交联并尽量减少毒性。

接下来，将培养板转移至装有冰的容器中，并弃去培养基。然后，用 5 毫升预冷的 PBS 轻柔冲洗培养板。加入 2 毫升预冷的 PBS，并将去盖的培养板放入配备发射 UV-B 的灯管的交联仪中。

以每平方厘米1焦耳的能量照射培养皿。高效的紫外交联至关重要。我们推荐使用UV-B光，但也可使用UV-A光。

在任何情况下，所使用的紫外能量应进行优化，并可通过 PAR-CLIP 或 ChIRP 进行监测。使用细胞刮收集细胞，并将其转移至含有预冷 PBS 的锥形管中。随后，在 2000 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟。

弃去上清液，将细胞沉淀重悬于5毫升冰预冷的含2毫摩尔EDTA和0.2毫摩尔PMSF的PBS中。使用血细胞计数板对细胞进行计数。预期从10厘米和15厘米培养皿中分别获得5×10⁶至1×10⁷个细胞和1×10⁷至2×10⁷个细胞。

然后，在 2000 × g、4 °C 条件下离心细胞 5 分钟。为从细胞中分离细胞核，请按照文本方案制备冰冻的缓冲液 A。使用前，向所需体积的缓冲液 A 中加入 0.5 mmol/L DTT 和 0.2 mmol/L PMSF。加入 2 mL 冷缓冲液洗涤细胞，然后在 2500 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟。

弃去上清液，加入含有0.2%非离子型非变性去污剂的缓冲液A，然后在4摄氏度下旋转样品5分钟。以2500 ×g离心5分钟后，移除上清液。沉淀物包含无细胞质的完整细胞核。

为了裂解细胞核，向离心管中加入 200 微升裂解缓冲液。使用 1/8 英寸探头，在 50% 振幅条件下超声处理样品 5 至 10 秒，以剪切染色质。在 12000 ×g 条件下离心 5 分钟，收集上清液 175 微升，避免触及沉淀。

接下来，通过 Bradford 法或类似技术测定蛋白质浓度。然后，使用裂解缓冲液将不同样品中的蛋白质稀释至 1 毫克/毫升或最低样品浓度。向核裂解液中加入 5 毫摩尔的 DTT 溶液，并在室温下孵育样品 1 小时。

然后，从新配制的储备液中加入14毫摩尔的碘乙酰胺，并将裂解液在室温下避光孵育30分钟。用5倍体积的50毫摩尔碳酸氢铵稀释裂解液，然后加入胰蛋白酶。将样品在37摄氏度下孵育过夜。

为每个样品制备一个定制的阶段尖端，在200微升移液器尖端底部放入一片固相萃取C18材料。在C18圆盘上方加入50微升Oligo R3反相树脂，然后将阶段尖端放入离心适配器中，并将适配器置于1.5毫升微量离心管内。向尖端加入100微升100%乙腈以洗涤。

然后以1000 × g离心1分钟，以去除溶剂。用50 µL的0.1%三氟乙酸（TFA）平衡移液头，再离心一次。

向消化后的蛋白质样品中加入100%甲酸，将pH值调节至2至3。然后将样品加载到自制的Stage Tip上，以1000 × g离心1分钟，直至样品完全通过Tip。用50 µL 0.1%三氟乙酸（TFA）洗涤结合的肽段。

然后，将样品在1000 × g条件下离心1分钟，通过向Stage Tip中加入50 µL洗脱缓冲液洗脱肽段，并在1000 × g条件下离心1分钟，使洗脱缓冲液从Tip中流出。使用真空离心浓缩仪，在150 × g、1至3 kPa条件下干燥样品1小时。为去除样品中的交联RNA，将沉淀重悬于50 µL 2×核酸酶缓冲液中。

假设肽的浓度为每毫升1毫克时A280为1，通过280纳米处的吸光度测定肽浓度。使用2倍核酸酶缓冲液将所有样品调整至每毫升1毫克或最低浓度，然后为每个样品配制50微升水加1微升高纯度核酸酶的主混合液。将50微升肽样品与50微升水加核酸酶主混合液混合。

然后，将样品在 37 摄氏度下孵育 1 小时。最后，根据文本方案进行纳米液相色谱、质谱分析及数据处理。该图显示了小鼠 ESC 中 RBR id 结果的火山图。

与RNA识别基序结构域重叠的肽段以蓝色显示，表现出高度一致的耗竭水平。来自HNRNPC的RNA结合肽段以红色突出显示。图中所示为RBR id得分的热图，该得分用于估算蛋白质区域发生RNA结合的可能性。

该分值投影在剪接体亚基U1-70k的表面。根据晶体结构确定的RNA结合区域附近呈现亮红色，表明正确识别了蛋白质与RNA的相互作用。在本图中，TET2被鉴定为一种新的RNA结合蛋白（RBP），并通过将RBR id分值沿蛋白的一级序列进行绘制，将RNA结合活性定位至其C端区域。

最后，可通过使用野生型序列进行PAR-CLIP实验，并与缺失预测RBR的突变体信号进行比较，来验证该新型RBR的必要性。若操作得当，掌握该技术后可在两天内完成，总耗时七到八小时。在交联之前，可对细胞施加各种处理刺激，以回答其他科学问题，例如分化如何启动，或细胞周期如何调控RNA-蛋白质相互作用。

观看本视频后，您应能充分了解如何制备含有交联蛋白质-RNA复合物的组分，以通过质谱技术鉴定蛋白质与RNA相互作用的位点。