使用基板植入及预装物镜的微型显微镜进行小鼠钙瞬变研究

这种微型显微镜可在基板制备过程中减少牙科水泥的收缩问题，并提高在两种长度配置下对荧光信号进行微型显微镜记录的成功率。如果在基板制备过程中无法观察到荧光瞬变信号，请检查钙指示剂的表达情况以及中继透镜在脑片上的位置。首先将直径为1毫米的20号静脉留置针的内针安装到立体定位臂上。

将导管插入海马腹侧CA1区的目标区域。然后，以每分钟100至200微米的速度将微注射针插入海马腹侧CA1区，并以每分钟25纳升的速度向目标区域注入200纳升的病毒载体。病毒扩散10分钟后，以每分钟100至200微米的速度撤出微注射针。

消毒中继透镜后，将其浸泡在冷的无热原生理盐水中直至植入。使用带有热缩管的微型动脉夹夹住中继透镜，并以每分钟100至200微米的速度将其放置于目标区域上方。随后，用牙科水泥固定透镜。

安装微型显微镜时，先将物镜固定在底部，并将基板组装到微型显微镜上。用石蜡膜包裹基板外侧约10厘米。使用可重复使用的黏土，通过立体定位臂探针固定微型显微镜。

将物镜尽可能靠近中继透镜的上方对齐，使两片透镜之间的间距最小。使用牙科水泥固定基板的位置，确保水泥仅接触石蜡膜。待牙科水泥干燥后，移除石蜡膜、基板和微型显微镜，保留牙科水泥基座为空心结构。

用模具硅橡胶密封中继透镜，并在硅橡胶上覆盖一层薄的牙科水泥。将小鼠从立体定位仪上取下，放入恢复室中。进行基板固定时，用骨剪小心剪开牙科水泥的薄层顶面，移除硅橡胶。

用75%酒精清洁中继透镜表面。拧紧基板旁边的固定螺钉，将其固定在微型显微镜底部。调整对焦滑块，使其距离主外壳约2.7至3毫米。

设置完成后，将微型显微镜连接至数据采集板，并将其插入计算机的 USB 3.0 端口。运行由 UCLA 团队开发的数据采集软件。将曝光值调整为 255，增益调整为 64 倍，激发 LED 调整为 5%。要将微型显微镜连接至数据采集软件，请点击连接按钮，并观察数据采集软件的实时图像流，以中继透镜边缘作为定位标志。

找到中继透镜后，用手将微型显微镜物镜与中继透镜对齐。通过调节微型显微镜的不同角度和距离，开始寻找荧光信号。当微型显微镜处于最佳位置时，移动体视定位臂靠近微型显微镜，并使用可重复使用的黏土将微型显微镜固定在体视定位臂上。

通过轻微调节X、Y和Z轴臂来寻找最佳视野。通过旋转Z轴上的耳杆、齿条或可重复使用的黏土来调整物镜表面与中继透镜之间的角度。当至少有一个细胞在基底贴附期间表现出荧光瞬变时，表明病毒表达和透镜植入成功。

使用尽可能少的牙科水泥牢固固定基板，同时监测目标区域，以确保最佳位置不发生改变。在代表性研究中，假基板固定程序显示出优势，因其导致的基板位置偏移小于原始程序。基板的偏移还受到牙科水泥高度的影响。

固定在颅骨上方0.5厘米处的基板比固定在颅骨上方1厘米处的基板位移显著更小。在基板植入过程中成功成像的一个示例中，观察到麻醉动物体内荧光瞬变信号以及血管结构。即使在小鼠于其饲养笼中自由活动时，基板植入五天后仍可观察到荧光瞬变信号，仅位置发生轻微偏移。

随后对小鼠进行了钙成像。在少数情况下，基底铺板过程中出现了问题，例如除均匀背景外无任何信号，或可见白色细胞边缘，但无荧光瞬变信号。

使用尽可能少的牙科水泥将基板牢固地固定在目标区域至关重要。利用 slate 技术，研究人员可以长期观察该区域的神经活动。在获得适当许可的情况下，该方法还可用于观察视野内的神经网络。