小鼠上丘钙成像

我的研究聚焦于视觉信息处理机制中的神经编码。我们致力于揭示视觉信息在大脑中，特别是在上丘中的编码方式及其潜在的神经机制。为了理解视觉信息处理过程，科学家们综合运用多种方法，包括神经元形态学、顺行和逆行示踪、IL测序、神经建模、机器学习等。

挑战在于移除覆盖在SSA切口上的骨螺钉，并将骨片整体抬起，这种方法很可能失败，因为骨片与硬脑膜相连接。通过将两张图像合并到一幅宽场钙成像图中，我们近期的研究揭示了小鼠上丘（SC）在单细胞分辨率和全局尺度上对运动方向响应的功能架构。我们发现，在全局范围内，具有相似偏好性的神经元形成斑块状分布，其尺度可达500微米，这些神经元对朝向鼻侧向上的运动方向表现出响应偏好。

通过本实验方案，我们解决了两项研究难题。首先，研究人员能够在不损伤皮层的情况下，以单细胞分辨率对小鼠上丘进行长期钙成像。其次，研究人员可以利用宽场显微镜记录上丘整个区域的神经活动。

本方案提供了一种在皮层完整的野生型小鼠中，以单细胞分辨率对后内侧上丘进行成像的激光方法。同时，我们使用一种生物相容性塞子暴露上丘，从而减少对长期成像的影响。我们的结果为研究大视野范围内视觉信息的神经编码提供了一种途径。

结合光遗传学技术，可研究来自不同脑区的半侧输入对上丘（SC）神经活动的调控作用。通过在丙烯酸培养皿中滴加一滴PBS开始制作吸管。使用21号平头针，利用毛细作用使针尖充满PBS。用半透明硅胶粘合剂覆盖针尖，并静置约10分钟。

用剪刀将硅胶粘合剂裁剪成直径为2毫米的圆片。准备塞子时，取一片厚度为0.75毫米的塑料垫片，并在其中心裁出一个1厘米×1厘米的正方形孔。用酒精清洁垫片和两块丙烯酸块，并用镜头纸擦拭。

将垫片材料放在一块丙烯酸块上，并在中心位置注入硅胶粘合剂，填充至开口的90%。再放上另一块丙烯酸块。施加约一千克的力，静置20分钟。

在手术显微镜下，用手术刀将硅胶粘合剂切割成 1 × 1.5 毫米的三角棱柱。使用粘性塑料胶带去除三角棱柱上的任何灰尘，并将其放置在玻璃盖玻片上。将带有三角棱柱的盖玻片置于电晕处理仪下，然后开启仪器。

将电晕处理仪移近盖玻片，直至出现电火花，并保持该位置数分钟，直到棱镜与盖玻片粘合。将插头放入培养皿后，在70摄氏度下孵育过夜。首先，使用耳杆将麻醉后的小鼠固定在立体定位仪上。

在小鼠眼部涂抹眼膏以防止干燥，并使用恒温加热垫将小鼠体温维持在37摄氏度。剃除毛发并对手术部位进行消毒后，注射利多卡因、替利定和美洛昔康。去除脊髓上方皮肤后，用棉签清洁颅骨。

调整立体定位仪，直至颅骨表面平整。使用钻头在人字缝外侧0.5毫米、前方0.42毫米处钻孔，直至暴露硬脑膜。使用斜面玻璃微移液管，在距人字缝深度1毫米和1.6毫米处注射表达GCaMP6m的腺相关病毒（AAV）。

注射后，缓慢撤出注射器，随后进行头板植入。将病毒载体注射到小鼠脑内后，清理覆盖在颅骨上的肌肉和组织，并用刀片轻刮颅骨表面。在冰上的陶瓷碗中，通过混合四分之三勺聚合物、三滴单体和一滴催化剂来配制牙科粘合树脂胶泥。

将混合物涂抹于头板和颅骨上，进行固定，并等待粘合剂固化五分钟。最后，注射抗生素以预防感染。

将小鼠从立体定位仪上取下后，将其置于加热垫上恢复，并在麻醉苏醒后放回饲养笼。病毒注射三周后，对小鼠进行麻醉，并使用头固定板将其固定在立体定位仪上。用生理盐水浸湿明胶海绵，以防止可能的出血。

使用微型钻头在人字缝后0.5毫米处创建一个3毫米×2毫米的椭圆形区域。将椭圆形边缘区域磨薄至出现裂纹，然后进一步磨薄椭圆记录窗前方的颅骨，以便将盖玻片紧密贴近脊髓。使用精细镊子取下骨瓣。在横窦后方沿硬脑膜做一切口，并移除该部分硬脑膜组织。

用明胶海绵和棉签将颅骨和记录窗干燥，然后在记录窗内滴加一滴硅胶粘合剂。使用吸杯通过负压固定塞子，并利用电动显微操作器移动吸杯，将塞子缓慢下降至硅胶粘合剂中，直至盖玻片接触颅骨。头板清洁后，在塞子边缘涂抹丁基氰基丙烯酸酯和树脂水泥，以将塞子固定在头板上，随后进行成像。

植入头板和堵头后，将动物固定在带有头板的旋转跑轮上。将跑轮置于双光子显微镜下方，并调节至适当高度。在物镜与头板之间放置一个黑色铝制锥形罩，以防止视觉刺激显示器产生的光线干扰。

进行双光子成像时，将样品平面上的激光功率调节至20至80毫瓦之间。以4.8赫兹的频率扫描600乘以600微米的视野，空间分辨率为每像素2.4微米，并对深度达350微米范围内的神经活动进行成像。使用旋转编码器记录小鼠在跑步机上的运动情况。

使用配备50毫米镜头的相机记录其瞳孔大小和位置。最后，通过记录刺激计算机发送的触发信号，将这些记录和图像采集与视觉刺激同步。展示了野生型小鼠上丘神经元的钙反应以及荧光在各图像间的标准差投影。

首先，在大脑皮层后部未能发育的突变小鼠中，向上丘（SC）每侧中心部位深度200微米处注射100纳升表达GCaMP6M的腺相关病毒（AAV）。约三周后，在上丘上方植入直径为5毫米的盖玻片。固定盖玻片后，通过发射滤光片以10赫兹的频率使用CMOS相机采集图像。采用宽场显微镜对部分皮层缺失突变小鼠上丘神经元的钙反应进行成像。

获取的图像被下采样至原始尺寸的四分之一，并展示了视觉诱发的钙反应。