钩端螺旋体（Leptospira）致病种中CRISPR干扰（CRISPRi）技术在基因沉默中的应用

我叫Jarlath Nally，是位于爱荷华州艾姆斯的美国国家动物疾病中心研究团队的一员，我们从事钩端螺旋体病的研究。钩端螺旋体病是一种被忽视的疾病，也是一种全球性分布的疾病。

实际上，我们对这类独特细菌如何引起感染的理解还非常有限。因此，今天的报告将介绍一种新工具，该工具可通过一种称为CRISPR干扰（CRISPR interference）的技术，特异性沉默钩端螺旋体表达的特定基因，从而促进对钩端螺旋体病致病机制的评估。然而，筛选新菌落的能力在很大程度上依赖于为这些营养要求苛刻的钩端螺旋体提供最佳的培养基。

首先，我们将向您介绍 Rick Hornsby，他将简要介绍一种用于培养这些难养细菌的新型培养基。随后，我们将介绍 Louis Fernandez，他将讲解利用 CRISPR 干扰技术在钩端螺旋体中沉默目标基因的方法。大家好，我是 Rick Hornsby。

自从 Anada 在 100 多年前发现钩端螺旋体以来，这类细菌通常在 29 摄氏度的温度下进行分离和培养，而这一温度既不能反映自然环境，也无法模拟哺乳动物宿主的体温。10 年前，美国农业部经济研究局（USDA ERS）开始研究改进钩端螺旋体培养基，由此开发出了 Hornsby-Alt-Nally 培养基。利用这种培养基，临床医生和研究人员能够在更接近哺乳动物宿主体内环境的温度和条件下，更快地从野外病例样本以及体外研究中分离和培养钩端螺旋体。

我们仍在持续优化这种培养基，但目前来看，HAN 已显示出巨大潜力，可显著改善钩端螺旋体病的兽医和人类临床分离株的体外研究，并推动预防钩端螺旋体病的更有效疫苗的开发。大家好，我是 Louis Fernandez。迄今为止，钩端螺旋体病的发病机制仍未得到充分探索，主要原因在于缺乏高效且易于操作的遗传操作工具。

在这里，我们将介绍一种名为CRISPR干扰（CRISPR interference）或CRISPRi的新技术。该技术非常简单，因为我们只需要表达两个组分：一种称为死亡Cas9（dead Cas9）或dCas9的DNA结合蛋白，以及一种称为单链向导RNA（single-guide RNA）的嵌合RNA分子。dCas9与向导RNA形成的复合物将与我们的目标基因进行碱基配对，从而降低甚至阻断其转录。

此外，通过使用新描述的HAN培养基，我们能够显著缩短突变体恢复过程中的菌落形成时间。第一步是确定将包含在向导RNA中的原间隔序列。该序列由20个核苷酸组成，用于与目标基因进行碱基配对。

将核苷酸序列提交至网络服务器 CHOPCHOP，参数设置为化脓性链球菌、Cas9 和原间隔序列邻近基序 NGG。根据结果，在负链趋势中选择评分最高的原间隔序列。NGG 基序不会包含在最终序列中。

我们一直使用lipL32启动子来表达单导向RNA，该RNA在5'端包含20个可变核苷酸，与保守的dCas9骨架相连。获得表达盒后，将其插入PMaOri质粒的XmaI限制性酶切位点。

用于接合的钩端螺旋体细胞在 HAN 培养基中于 29 或 37 摄氏度下培养。接合前一天，将供体菌株的细胞在添加了二氨基庚二酸（DAP）和壮观霉素的 LB 培养基中培养。接下来，在接合当天，将含有 DAP 的 LB 培养基中培养至饱和的大肠杆菌（E.coli）菌液进行处理。

在生物安全柜内，将膜滤器放置在玻璃底座上方，再将15 mL玻璃漏斗置于其上，组装过滤装置。两个部件通过此弹簧夹固定在一起。然后将玻璃装置连接至真空泵，向漏斗中加入5 mL钩端螺旋体培养物。

接下来，加入含有目的质粒的大肠杆菌 Beta 2163 菌株。加入的体积需根据菌液的光密度进行调整。我们的目标是实现一对一的细胞接种。

开启真空泵，此时液体将通过膜，细胞则会被浓缩在膜的上方。取出滤膜，将其放置于添加了DAP的EMJH平板上，弯曲面朝上。将平板在29°C条件下培养24小时。

然后从培养板中取出滤膜，放入 50 mL 的锥形管中。用 1 mL 液体 HAN 培养基通过移液操作从滤膜上回收细胞。通过暗视野显微镜观察回收的细胞。

此阶段可观察到大肠杆菌与钩端螺旋体数量相当。取100至200 µL菌液涂布于含链霉素的HAN平板。此阶段省略DAP，大肠杆菌无法生长。

平板在37摄氏度、3% CO2条件下孵育。菌落通常在8至10天之间可见。钩端螺旋体（Leptospira interrogans）菌落较难观察。

此处我们展示的是过度生长的菌落，以便更清楚地观察。向1.5 mL离心管中加入100 µL液体HAN，用于回收突变株。建议从每块平板上至少挑取三个菌落。

使用移液器吸头从平板上挑取单个菌落。预计 Agger 将单独被挑取。菌落应从含有 MTP PMaOri 的对照平板上获取。

dCas9 质粒，以及含有携带 dCas9 和针对目标基因设计的向导 RNA 质粒的钩端螺旋体平板。回收的细胞现在可通过暗视野显微镜观察，以确认是否存在有活力的钩端螺旋体。

在观察到离开的钩端螺旋体后，将细胞转移至含有壮观霉素的液体HAN培养基中。培养生长后，可回收细胞以进行基因沉默效果确认和表型评估。如果存在针对目标蛋白的抗体，免疫印迹是一种直接有效的评估沉默效果的方法。

通过PCR和木制侧翼引物评估含有pMAOri的钩端螺旋体，仅含dCas9或同时含有向导RNA Cas的情况。当存在向导RNA表达盒时，DMT质粒将产生约300个碱基对的条带，而仅在约700个碱基对处获得一条条带。

使用全细胞提取物进行免疫印迹以确认基因沉默效果，结果表明，在含有表达dCas9和靶向该基因的向导RNA质粒的细胞中，lipL32蛋白的表达被完全抑制。同时，在含有该向导RNA的细胞中，link a和link B均不存在，说明其对这两个基因具有特异性。对照蛋白lipL41在所有泳道中均可检测到。

我们已在问号钩端螺旋体（leptospira interrogans）中应用了CRISPR干扰技术，同时也将其用于其他多种致病性钩端螺旋体物种。我们利用该技术沉默特定基因，以及小非编码RNA的表达。我们的研究兴趣在于解析感染的致病机制，因此通常致力于鉴定毒力相关因子，但显然您也可根据自身研究领域选择目标基因进行沉默。

例如，这可能涉及运动性、钩端螺旋体在环境中持久存在的机制，或其代谢过程。无论哪种情况，您都应能够构建特定的突变株，从而开展功能基因组学研究，并理解目标基因的生物学意义。因此，来自美国国家动物疾病中心全体研究人员，衷心祝愿您的研究取得圆满成功。