基于CRISPR干扰的基因沉默：一种在致病性Leptospira中靶向抑制基因功能的技术

CRISPR干扰（CRISPRi）利用一种失活的Cas9变体dCas9实现靶向基因沉默，从而抑制基因功能。

进行CRISPRi时，使用穿梭载体构建体——一种含有对应于大肠杆菌（E. coli）和钩端螺旋体（Leptospira）细菌复制起点的质粒，可在两种物种中实现扩增。

该载体还包含一段针对 dCas9 基因的特异性序列以及一段单导向 RNA（sgRNA），用于识别目标序列。

最初，穿梭载体存在于供体 E. coli 中。将宿主 Leptospira 加入供体 E. coli 培养物中，以促进接合。接合过程在生物体之间建立直接的细胞间接触，有助于 Leptospira 摄取穿梭质粒。在细胞内，质粒构建体产生 sgRNA 序列并表达 dCas9 蛋白。

sgRNA 包含一个原间隔序列区，该区域可识别 Leptospira DNA 上与之互补的靶序列区域，该区域靠近原间隔序列邻近基序（PAM）——即宿主 DNA 上的一段短识别序列。这有助于 dCas9 在基因转录起始位点下游的靶位点处与 sgRNA 形成复合物。

sgRNA-dCas9 复合物中的 dCas9 不具备切割 DNA 链的催化活性，而是作为物理屏障阻碍形成 mRNA 的 RNA 聚合酶的移动，最终抑制基因转录。将基因沉默的 Leptospira 用于进一步检测。

进行接合时，Leptospira 细胞在 HAN 培养基中于 29 或 37 摄氏度下培养。接合前一天，供体 E. coli 细胞在添加了二氨基庚二酸（DAP）和壮观霉素的 LB 培养基中培养。

接下来，在接合当天，将饱和的 E. coli 培养物在 LB 培养基中加入 DAP 进行培养。在生物安全柜内，将膜滤器置于玻璃底座上，再将 15 mL 玻璃漏斗放在膜滤器上方，组装过滤装置，两部分由弹簧夹固定。然后将玻璃装置连接至真空泵。向漏斗中加入 5 mL Leptospira 培养物。

接下来，加入含有目的质粒的 E. coli β2163 菌株。加入的体积需根据菌液的光密度进行调整。我们的目标是达到 1:1 的细胞比例。开启真空泵。此时，液体将透过滤膜，细胞则被浓缩在滤膜表面。

取出滤膜，将其放置于添加了DAP的EMJH平板上，细菌面朝上。将平板在29摄氏度下培养24小时。随后，从平板上回收滤膜，并将其放入50 mL锥形管中。

用1 mL液体HAN培养基通过移液从滤膜上回收细胞。采用暗视野显微镜观察回收的细胞。

在此阶段，可观察到数量相当的 E. coli 和 Leptospires。取 100 至 200 微升菌液，涂布于两块含有壮观霉素的 HAN 平板上。此阶段省略 DAP，因此 E. coli 无法生长。将平板置于 37 摄氏度、3% CO₂ 条件下培养，菌落应在 8 至 10 天内显现。