人多能干细胞来源的肠道和结肠类器官的生成、维持与表征

以下方案描述了来自人类多能干细胞的一代人类肠道和结肠类器官。这种技术将允许用户询问与肠道模式形成有关的途径。该技术允许用户生成同基因的区域特异性类器官。该协议可以深入了解调节肠道模式建立和维持的因素。

[旁白]首先将细胞外基质或 ECM 包被的 24 孔板放入生物安全柜内 30 分钟，使其达到室温。将 mTeSR1 完全培养基细胞分离溶液和高级 DMEM 放入 37 摄氏度的珠浴中，让它们预热 30 分钟。通过加入 13 毫升 mTeSR1 和 13 微升 10 毫摩尔 Y-27632 Rho 相关蛋白激酶或 ROCK 抑制剂，在 50 毫升锥形管中制备铺板培养基。要从六孔板中收集细胞，请从三到四个孔中吸出培养基，并每孔用两毫升高级DMEM洗涤一次。吸出先进的DMEM，并将一毫升细胞解离溶液分配到每个孔中。将板在 5% 二氧化碳、37 摄氏度的培养箱中孵育 5 至 7 分钟。使用五毫升移液器上下移液四到五次来制备细胞悬液，从而解离任何细胞团块。向每个孔中加入两毫升高级DMEM。轻轻上下移液四到五次，然后转移到 15 毫升锥形管中。在室温下以300G旋转细胞三分钟。从管中吸出培养基，而不吸出细胞沉淀。并加入6毫升制备的mTeSR1加ROCK抑制剂培养基。通过上下移液三到四次轻轻重悬细胞。然后将悬浮液转移到 50 毫升管内剩余的 mTeSR1 和 ROCK 抑制剂培养基中。剧烈重悬四到五次，并使用血细胞计数器计数细胞。在接种细胞之前从 24 孔板中吸出 ECM。通过上下移液两到三次再次重悬细胞，并在每个孔中分配0.5毫升细胞悬液。顺时针轻轻摇晃板三次，逆时针三次，前后三次，左右摇晃三次，使细胞均匀分散。将板转移到 37 摄氏度、5% 二氧化碳的培养箱中，孵育 24 小时。24小时后，吸出用过的培养基。每孔加入0.5毫升mTeSR1，并在相同条件下再次孵育24小时。通过将每毫升 100 微克激活素 A 储备溶液和每毫升 100 微克 BMP4 稀释到锥形管中的激活素第一天培养基中，制备激活素第一天完全培养基。在 37 摄氏度的珠浴中加热培养基。从24孔板中吸出mTeSR1培养基，每孔加入0.5毫升激活素第一天培养基。将板置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳的培养箱中，孵育 24 小时。24小时后检查细胞。通过将每毫升 100 微克激活素 A 储备溶液稀释到锥形管中的激活素第二天培养基中，制备激活素第二天完全培养基，并将管置于 37 摄氏度的珠浴中。从二氧化碳培养箱中取出 24 孔分化板，并取出用过的培养基。每孔分配 0.5 毫升预热的 Activin 第 2 天培养基，并将板放回二氧化碳培养箱中 24 小时。通过将每毫升 100 微克激活素 A 储备溶液稀释到锥形管中的激活素第三天培养基中，制备激活素第三天完全培养基，并将试管置于 37 摄氏度的珠浴中。取出用过的培养基，每孔分配 0.5 毫升 Activin 第 3 天培养基。首先将最终内胚层分化为中后肠球体，在50毫升锥形管中加入25毫升含有FGF4的中后肠诱导培养基，并将其置于37摄氏度的珠浴中30分钟。为了制备完整的中后肠诱导培养基，在培养基温热后加入7.5微升CHIR99021。取出用过的培养基，每孔分配0.5毫升中后肠诱导培养基，在37摄氏度，5%二氧化碳下孵育24小时。第二天单层内细胞凝结后，用新鲜的中后肠诱导培养基替换用过的培养基，并将板放回孵育24小时。为避免在更换培养基时丢弃漂浮的球体，将旧培养基转移到 15 毫升管中并以 300 G 离心一分钟。将球体重悬于12.5毫升新鲜的中后肠诱导培养基中，将每孔0.5毫升加入同一24孔板中，并在培养箱中孵育24小时。在后肠诱导的第四天，通过将培养基收集到15毫升管中，然后以300G离心一分钟，从平板孔中收获漂浮球体。通过对 FOXA2 和 SOX17 进行免疫荧光染色来评估根治性内胚层诱导的效率。发现前HOX因子HOXD3的mRNA表达在Noggin处理的人肠道类器官或HIO中最高，在上皮生长因子或EGF处理的HIO中表达较少，在BMP处理的人结肠类器官或HCO中最低。相反，发现 HOXA13 和 HOXD13 mRNA 表达在 HIO 中较低，在 HCO 中较高。对 SATB2、CDX2 和 CDH1 进行免疫荧光染色，以确定 HCO 上皮是否正确图案化。