大鼠肠道类器官的生成与操作

本研究建立了一种在长期细胞培养中稳定性良好的大鼠肠道类器官模型。我们还首次成功实现了利用慢病毒感染和瞬时转染进行的遗传操作。该模型为在体内遗传工具有限的大鼠中研究肠道生物学提供了极佳的实验平台。

大鼠肠道类器官此前难以进行长期培养。通过建立一种稳定且可进行遗传操作的大鼠类器官模型，我们为研究人员提供了更大的灵活性和选择空间，使其能够根据特定研究条件选用最合适的类器官模型。小鼠肠道类器官常被用于研究干细胞行为、细胞命运决定及生理学特性，但由于小鼠与人类生物学之间存在关键差异，其作为模型可能存在局限性。

另一方面，人类肠道类器官的获取较为困难，且细胞培养条件复杂。本文所述的大鼠类器官模型在保持与人类生物学关键生理相关性的同时，相较于人类肠道类器官更易于获取和维护。建立并优化大鼠肠道类器官模型，可在一种易于操作且具有重要生理相关性的模型中，实现对肠道生物学的遗传操作、药物处理以及高通量研究。

此外，这些大鼠类器官将有助于研究肠道疾病模型中物种特异性的生理特性、细胞命运决定以及表型变异。首先，将已处死的大鼠仰卧置于解剖台上。用无菌镊子夹起皮肤层，并在表面进行剪切，注意避免损伤内部器官。

使用大型锋利的解剖剪，在腹部中央沿纵轴方向做一表层切口，然后从该切口向两侧分别做两个较短的横向切口。用镊子将皮肤剥离，暴露腹腔。切开腹膜，充分暴露腹腔内的内脏器官，以便易于接触肠道。

使用剪刀和镊子找到胃，并在其远端约两到三厘米处识别出呈黄白色的十二指肠段。空肠近端位于屈氏韧带（十二指肠与空肠之间的解剖标志）远端约四到五厘米处。将分离的肠段放入一个10厘米的培养皿中。

用10毫升冰冻的PBS冲洗目标肠段的肠系膜，直至清除管腔内容物。在纸巾上将肠段切成2厘米长的小段，然后沿纵轴切开每段肠组织，以暴露上皮层。

使用玻璃载玻片刮取暴露的管腔表面，以去除绒毛。将肠段放入预冷的 EDTA 溶液中，置于冰上，并在 4°C 下以 10 RPM 的转速于试管旋转仪中旋转孵育 30 分钟。在解剖显微镜下，将管内液体倒入一个 10 厘米的培养皿中。

加入额外的 5 毫升冰冻 PBS。用精细镊子夹住一段肠道，剧烈振荡以观察上皮组织释放到 PBS 中。最初，PBS 中主要含有绒毛。

持续振荡肠道碎片。定期弃去含有绒毛的 PBS，并向肠道碎片中加入 10 毫升新鲜 PBS。继续振荡碎片，并重复 PBS 洗涤步骤，直至绒毛不再释放到 PBS 中，此时 PBS 主要含有隐窝。

弃去剩余的肠组织碎片，将平皿中剩余的 PBS 进行肠道隐窝富集。在组织培养超净台中，收集含有隐窝的 PBS 溶液，并通过 70 微米细胞滤网过滤。将滤液在 250 × g 离心 5 分钟。

然后去除上清液，并将沉淀重悬于五毫升 Advanced DMEM Plus 中。再次以 250 × g 离心五分钟，去除上清液，仅保留 50 微升培养基与沉淀在一起。将沉淀在剩余培养基中重悬，并加入到冰上的细胞外基质提取物（EME）分装液中。

轻轻吹打使隐窝均匀悬浮于EME中，避免产生气泡。将50微升EME滴加到35毫米组织培养皿中，于37°C、5%二氧化碳条件下孵育20分钟。

孵育后，加入2毫升含有10微摩尔Y27632和10微摩尔CHIR99021的大鼠肠道类器官培养基（RIOM）。接下来，传代大鼠肠道类器官时，吸去含有类器官的培养板中的培养基，并加入1毫升解离试剂，以使类器官从EME半球状结构中释放。将含有解离后类器官碎片的解离试剂转移至15毫升锥形管中。

用两毫升 Advanced DMEM Plus 洗涤培养板，并将其加入含有破碎类器官的 15 毫升锥形管中。使用玻璃巴斯德吸管，轻柔吹打 15 至 20 次，以破碎类器官。在 350×g 离心 2 分钟，然后将管底 50 微升溶液加入 EME 中。

混合溶液后，取50微升EME类器官加入35毫米组织培养皿中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育20分钟。孵育结束后，加入2毫升RIOM培养基，其中分别含有10微摩尔的Y27632和CHIR99021。图中展示了绒毛片段和隐窝的代表性图像。

隐窝的尺寸比绒毛小。接种的类器官在接下来的几天内逐渐扩展，并在第4至7天开始出芽并分化。解冻后培养两天，健康的类器官培养物中可见球状体和出芽状类器官。

相同类器官系在包被后显示出单个类似隐窝结构的存在。使用EME包被培养板时，将EME用冷的Advanced DMEM Plus以1:20比例稀释。进行胶原包被时，将浓度为每毫升5毫克的胶原在Advanced DMEM Plus中稀释至100微克每毫升。

用200微升稀释的EME或胶原蛋白包被培养板，确保完全覆盖孔表面，在37摄氏度孵育1至2小时。为形成单层细胞，从含有类器官的35毫米培养板中吸出培养基。加入1毫升PBS，用P1000枪头在孔中反复吹打约20次，以分散孔中的EME，使所有EME松动。

将内容转移至一个15毫升的锥形管中。向培养板中加入1毫升PBS以收集额外的类器官，并将其转移至同一锥形管中。以350×g离心2分钟，弃去上清液，包括任何EME残留物。

然后向类器官沉淀中加入1毫升胰蛋白酶溶液，在37摄氏度下孵育2分钟。使用P1000枪头吹打10次，加入2毫升Advanced DMEM Plus以中和胰蛋白酶。在350 ×g离心5分钟，吸除上清液，再将沉淀重悬于4.8毫升RIOM 2D培养基中。

去除 Advanced DMEM Plus 中各孔内多余的 EME 或胶原蛋白。然后向每个预先包被的孔中加入 200 微升 RIOM 2D 中的类器官和 10 微摩尔的 Y27632。4 至 16 小时后，收集培养基并在 1000G 离心 1 分钟。

将上清液转移至新的15毫升锥形管中，并弃去沉淀。每次加入200微升离心后的RIOM 2D前，用300微升PBS洗涤每个孔。每两到三天更换一次RIOM 2D，同时暂停使用Y27632。当将EME重新加至细胞上层时，接种在EME上的2D单层细胞 readily 重新形成小球状结构。

相比之下，仅使用胶原蛋白一型基质不足以重建三维结构。