活性分离 秀丽隐杆线虫 核提取物制备与重组 体外 转录

该方案填补了秀丽隐杆线虫（C.elegans）生化研究中的技术空白，拓展了其作为模式生物的应用价值。此技术既简单又可靠，能够稳定地分离出具有功能活性的秀丽隐杆线虫核提取物。首先，将同步化的L1期线虫接种于10个含有大肠杆菌OP50的150毫米线虫生长培养基平板上，在20摄氏度条件下培养48小时，直至线虫发育至L4期。

配制好低渗和高渗缓冲液后，用70%乙醇充满Balch匀浆器的研磨腔以进行清洗。随后用去离子水冲洗研磨腔，以去除残留的乙醇。将碳化钨球放入研磨腔中。

用盖子封闭 Balch 匀浆器筒的两端，并用提供的拇指螺丝固定盖子。然后按照文本稿件中的描述，每份样品准备 5 毫升完全低渗缓冲液和高渗缓冲液。接下来，用无菌的 2 毫升注射器吸取 1 毫升完全低渗缓冲液，轻轻冲洗 Balch 匀浆器的研磨腔，使约 500 微升的完全低渗缓冲液留在腔内。

将冲洗后的匀浆器置于冰上，冷却30分钟。用M9缓冲液收集喂养充分的L4期动物至15毫升锥形管中，在1,000 × g离心3分钟。弃去上清液，并继续洗涤动物沉淀，直至上清液澄清。

随后用 3 毫升冷的低渗缓冲液洗涤动物样品，并如前所述再次离心。去除上清液中的低渗缓冲液后，向动物沉淀中加入 1 毫升完全低渗缓冲液，将动物悬液转移至一个新的无菌 2 毫升注射器中。为在冰上匀浆动物样品，轻轻推动注射器使动物样品通过装有钨球的 Balch 匀浆器研磨腔。

然后将动物样本重新收集到注射器中，重复此操作30次。经过30次匀浆循环后，从Balch匀浆器中收集尽可能多的动物悬液，并将注射器尖端朝下置于1.7毫升微量离心管中保存。取出钨珠，并用去离子水清洗研磨腔。

干燥后将球放回相应标记的试管中。然后将直径为7.9880毫米、间隙为12微米的钨球插入研磨室，并重新密封匀浆器。再次用1毫升冰冻的完全低渗缓冲液冲洗研磨室。

按所示方法研磨悬浮液25次。将动物悬浮液转移至一支洁净的1.7毫升离心管中，并将悬浮液置于冰上保存。通过离心沉淀动物体及碎片。

用移液器将40微升上清液转移至标记为输入组分的离心管中，并将该组分置于冰上保存。将剩余的上清液转移至一个新的1.7毫升离心管中，注意不要扰动沉淀，然后离心以沉淀细胞核。随后，将上清液（不要扰动已沉淀的细胞核）转移至另一个标记为胞质组分的新1.7毫升离心管中。

为洗涤细胞核沉淀，向沉淀中加入500微升完全低渗缓冲液，重悬沉淀，并在4摄氏度下以4,000 × g离心5分钟。离心结束后，将细胞核沉淀重悬于500微升新鲜的完全低渗缓冲液中，再次按上述条件离心样品。然后将沉淀溶解于40微升完全高渗缓冲液中。

将核悬液转移至新标记为“核组分”的1.7毫升离心管中，置于冰上保存。使用荧光定量试剂盒测定三个组分的蛋白质浓度。将核组分分装至含有6微克核蛋白的单次使用离心管中，于干冰与乙醇混合物中快速冷冻。

将样品储存在零下80摄氏度，直至进一步使用。代表性凝胶图像显示了使用CMV启动子DNA模板时，秀丽隐杆线虫L4幼虫核提取物的转录产物。成功分离出有活性的核蛋白后，在体外转录中产生一条132个碱基对的条带；而分离不成功则导致条带微弱或无条带出现。

请务必清楚标记完整的缓冲液。不合适的缓冲液可能损害核蛋白的功能。同时，保持匀浆器处于冰冻状态，以防止蛋白质变性。

开发这一技术使研究人员能够测量秀丽隐杆线虫（C.elegans）在应激条件下的RNA转录速率，结果表明该动物的转录速率会随环境条件的变化而改变。