研究RNA-蛋白质相互作用的电泳迁移率变动分析（EMSA）：以IRE/IRP为例

以下实验的总体目标是利用电泳迁移率变动分析法，从细胞提取物中分析RNA与蛋白质的相互作用。该过程首先通过独立步骤制备来自细胞或组织的蛋白质提取物，同时合成并纯化基因特异性的放射性标记RNA探针。随后将蛋白质提取物与标记的RNA探针混合，以促使特异性RNA-蛋白质复合物的形成。

最后，将反应产物上样至非变性聚丙烯酰胺凝胶，通过电泳进行分析，游离RNA探针因其迁移速度较快而与RNA-蛋白质复合物分离。电泳迁移率变动分析（EMSA）被广泛用于研究RNA与蛋白质的相互作用。我们可以利用该方法分析铁调节蛋白IRP1和IRP2与其靶RNA元件的结合情况。

但该方法也可用于研究其他RNA结合蛋白。本操作流程将由我实验室的研究助理Dr. Kain Philippine和博士后研究员Dr. Nicole Wilkinson共同演示。对于在培养皿中生长的贴壁细胞，用预冷的PBS洗涤细胞两次，然后加入1毫升预冷的PBS，用塑料细胞刮刀收集细胞。将细胞悬液转移至新的1.5毫升离心管中。

将离心管放入预冷的4°C微量离心机中，在低速条件下离心5分钟，然后吸除上清液。细胞将形成位于离心管底部的白色沉淀。

每收获 1000 万个细胞，加入 100 微升预冷的细胞质裂解缓冲液。通过反复吹打使细胞沉淀充分悬浮，然后将悬液置于冰上孵育 20 分钟。此步骤可溶解细胞膜，使所有胞质成分释放至缓冲液中。

为了分离可溶性胞质组分，将离心管在4°C的离心机中以最大转速离心10分钟，将澄清的上清液转移至冰上预冷的新1.5毫升离心管中，并弃去沉淀。接下来，使用Bradford法测定所得胞质提取物的总蛋白浓度。将胞质提取物分装至较小的离心管中，于-80°C保存备用，用于从新鲜组织制备胞质提取物。

将已处死的动物置于解剖板上的洁净垫上，开始收获过程。用剪刀切开腹部，使用剪刀和镊子取出肝脏和脾脏。

用约 50 毫升冰冷的 PBS 冲洗每份组织，以防止组织降解。立即用解剖刀将组织切成约 1 至 2 立方毫米的小块，不得延迟。将组织放入新的冻存管中，迅速冷冻。

将样品在液氮中速冻。将冻存的组织保存在零下80摄氏度，直至需要时使用。开始制备胞质提取物时，将先前冻存的组织样品转移至含有250至500微升预冷裂解缓冲液的2毫升平底离心管中。

将组织匀浆器的探头放入离心管中，并以中等功率开启仪器。匀浆10秒后，立即将离心管置于冰上放置20分钟，以防止蛋白质变性。为分离胞质组分，在4°C离心机中以最大转速离心10分钟，随后将澄清的上清液转移至预冷的1.5毫升离心管中，弃去沉淀。

使用 Bradford 法测定所得细胞质提取物的总蛋白浓度。将所得细胞质提取物分装至较小的离心管中，并于负80摄氏度保存，直至使用。在继续本实验方案之前，设置一个配备有机玻璃屏蔽装置和盖革计数器的放射安全工作台。

使用细胞计数仪监测实验服上的标签，并配备适当的放射性专用锐器和非锐器废弃物容器。以含有克隆铁反应元件的去线性化质粒DNA作为模板，在室温下用移液器混合模板、反应缓冲液、部分放射性核苷酸和RNA聚合酶，设置20 µL的体外RNA转录反应体系。

为启动RNA合成，将样品在40摄氏度孵育一小时。加入一微升0.5摩尔EDTA（pH 8.0）以终止体外转录反应。通过上下吹打混匀EDTA。

现在使用标准的醇沉淀方法纯化RNA产物。首先，向合成后的混合物中加入10微升TRNA和82.5微升pH为5.2的3摩尔醋酸钠溶液，然后涡旋混匀。其中TRNA将作为沉淀载体，有助于提高最终RNA的沉淀得率。

加入273微升95%至100%的乙醇，通过涡旋振荡混匀。将离心管置于室温下静置10分钟，使沉淀反应进行，从而分离RNA；随后在室温下以最高速度离心10分钟。使用移液器小心弃去上清液，注意不要扰动沉淀物。

沉淀的RNA可能以靠近管底的小白色沉淀块形式存在，也可能肉眼不可见。加入100至500微升70%乙醇洗涤沉淀。在室温下以最高速度离心10分钟，然后打开管盖倾倒弃去上清液。

将RNA沉淀在室温下敞口放置10至15分钟以充分干燥。加入100 µL无核酸酶的水重新溶解固态的放射性标记RNA。将RNA溶液置于液体闪烁计数器Eloqua中，以测定放射性核苷酸的掺入程度。

将放射性标记的RNA探针分装至小管中，并在负80摄氏度下保存，直至需要时使用。冷冻的分装样品可在三周内使用。在开始电泳迁移率变动分析前，制备一块标准的6%非变性丙烯酰胺凝胶，尺寸至少为16厘米×16厘米，以方便每泳道加载较大的样品体积，并增强该尺寸凝胶的机械稳定性。

使用厚度至少为一毫米的玻璃垫片和梳子。开始电泳迁移率变动分析时，将先前冷冻的细胞质裂解液和用于实验蛋白质部分的放射性标记RNA探针在冰上解冻。用细胞质裂解缓冲液将25微克细胞质提取物稀释至终体积为10微升。

必要时，向混合物中加入一微升浓度为两摩尔的储备溶液，并将蛋白质样品置于冰上。对于RNA组分，用无核酸酶的水将放射性标记的RNA探针稀释至每微升200,000计数，于95°C加热变性1分钟，然后在室温下冷却至少5分钟。为启动蛋白质与RNA的结合反应，向蛋白质提取物中加入一微升放射性标记的RNA探针，在室温下孵育20分钟以允许结合反应进行。

为了提高电泳迁移率偏移实验的特异性，向反应体系中加入一微升肝素储存液。如果放射性标记的 RNA 探针长度超过 60 个核苷酸，则额外加入一微升 RNAs T1。在室温下继续孵育结合反应 10 分钟，以进一步增强特异性，并促进 RNA-蛋白质复合物的更好分离。

加入3 µL上样缓冲液，用移液器吹打混匀。然后将整个反应产物上样至6%丙烯酰胺凝胶中，在5 V/cm电压下电泳60分钟。务必使用适当的放射性屏蔽装置覆盖仪器。

拆卸凝胶电泳装置，将凝胶转移至一张大的滤纸上。在暗室中使用凝胶干燥真空装置干燥凝胶。将凝胶与滤纸的组合放置在一片之上。

曝光后，将胶片显影并晾干。最佳曝光时间可能从一小时到过夜不等。可通过铁含量不同的组织培养细胞，评估IRRP1和IRRP2对放射性IRE探针的铁依赖性结合能力。

因此，在先前用去铁胺处理的缺铁细胞中，IRE 结合活性被诱导。相反，在先前用血红素处理的富铁细胞中，IRE 结合活性受到抑制。IRP1 的 IRE 结合活性在铁硫簇组装后丧失，而 IRP2 则发生依赖于铁的降解。

IRP1的铁硫簇可被2%的巯基乙醇（2-ME）处理破坏，从而使其失活的IRE结合活性得以检测。IRP2的活性则不能通过2-ME恢复。在接下来的实验中，通过野生型、IRP1基因敲除和IRP2基因敲除小鼠的新鲜肝组织，评估了IRP1和IRP2的IRE结合活性随细胞内铁浓度变化的情况。

此处数据显示，给小鼠喂食已知可增加肝脏铁负荷的高铁饮食，会促进野生型小鼠肝脏提取物中IRP1和IRP2的IRE结合活性降低。IRP2与IRE形成的复合物会受到IRP1存在的干扰，但在IRP1基因敲除小鼠的肝脏提取物中，这些复合物可被清晰观察到。

此处高铁饮食导致 IRP2 完全失活。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用电泳迁移率变动分析来研究 RNA-蛋白质相互作用。请记住，RNA 探针的质量对实验成功至关重要。