通过大胞饮作用介导的ATP内化在人肿瘤细胞及肿瘤异种移植小鼠中的荧光显微镜检测

癌细胞具有从细胞外环境摄取营养物质（如ATP）的显著能力。本实验方案使我们能够展示ATP的内化过程，并可视化ATP在细胞内的定位。这种在大胞饮体中对内化ATP进行的高分辨率成像，非常适用于研究其特殊定位，并完成对内化过程的定量分析。

该方案描述了研究ATP内化的不同实验应用。此方法可用于研究细胞内化的多种机制，包括巨胞饮作用和外泌体介导的内吞作用。对于代谢性疾病，可利用本方案研究非癌细胞中的ATP内化。

首先，将癌细胞接种于一个225平方厘米的培养瓶中，培养基为添加了胎牛血清（FBS）和抗生素的DMEM。将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳的细胞培养孵箱中培养。当细胞融合度达到80%时，消化并脱离细胞，通过离心收集细胞沉淀，然后将细胞重悬于冰浴的磷酸盐缓冲液（PBS）中，调整细胞密度至每100微升PBS中含有5×10⁶个细胞。

将细胞悬液转移至1.5毫升微量离心管中。用75%乙醇清洁免疫缺陷小鼠侧腹部的注射部位，并用无尘擦拭纸擦去多余乙醇。用一支配有27号精密针头的一毫升无乳胶注射器吸取细胞悬液。

进行皮下注射时，将针头与皮肤呈约10度角，针尖斜面朝上，插入皮肤下方，仅使针头外露1至2毫米。在大约10秒内缓慢将细胞从注射器中推出。注射完全部体积后，保持针头原位3至5秒，然后拔出针头。

用手指对注射部位施加轻柔但稳固的压力，持续三到五秒，以防止注入物渗漏。使用游标卡尺监测并测量肿瘤生长，直至肿瘤体积达到200至500立方毫米。将300微升浓度为16毫克/毫升的高分子量荧光葡聚糖与无血清DMEM溶解，并在37摄氏度水浴中孵育30分钟，然后离心葡聚糖溶液，将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中。

取40微升浓度为1毫摩尔的不可水解荧光ATP储备液，加入160微升无血清DMEM培养基中，配制成0.2毫摩尔的不可水解荧光ATP溶液。通过混合先前配制的储备液，制备含有或不含100微摩尔不可水解荧光ATP的DMEM处理溶液，或含有8毫克/毫升高分子量或低分子量荧光葡聚糖的处理溶液。使用1毫升注射器吸取50微升其中一种处理溶液。

将溶液直接注射到异种移植肿瘤中，并对每种处理的四个生物学重复进行相同操作。在处死小鼠并分离肿瘤组织后，使用带孔的勺子舀取切除的肿瘤组织，立即将组织放入冷冻介质中并轻轻滚动组织，确保组织始终浸没在介质中，使所有组织表面均被覆盖。小心地将组织放入含有冷冻介质的包埋模具中。

将相应的标签垂直插入冷冻介质或模具中，确保标签上的文字部分露在介质外侧。当冷冻介质变为不透明的白色时，从模具中取出组织块，将组织块置于干冰上，并对每张肿瘤切片重复冷冻过程。在进行冷冻切片操作前，将组织块于零下80摄氏度保存数月。

制作组织块切片后，将组织切片置于-18摄氏度的95%乙醇中固定5分钟。用PBS洗涤固定后的切片5分钟。根据切片大小，向组织切片上滴加10至50微升含DAPI的水性封片剂，并盖上玻璃盖玻片。

封片后12至24小时，确定固定肿瘤切片中感兴趣的区域，并按照先前所述方法使用荧光显微镜采集图像。人肿瘤细胞固定并用DAPI孵育2至24小时后，使用落射荧光成像系统及数据采集软件获取图像。将玻片置于直立式落射荧光显微镜的载物台上，以双目模式观察。

打开成像程序，选择10倍物镜并调节载物台以确定焦距。以蛇形方式从左到右扫描玻片，以识别感兴趣的区域。选择40倍物镜，并使用显微镜上的切换开关从双目观察模式切换至图像采集模式。

单击实时质量图标以查看并随后采集图像。使用采集工具栏上的 OC 面板为每个滤光片组或荧光通道定义曝光参数，然后使用多通道采集工具栏，根据已设定的曝光参数采集三通道图像。或者，也可以通过手动切换滤光片组、设置曝光时间、在每个通道图像采集之间开关快门，并将各通道单独采集的图像进行叠加，从而手动采集多通道图像。

将图像保存为 nd2 文件。保存 TIF 文件，包括合并通道图像和各个通道图像。在已保存的 nd2 图像文件上，使用注释和测量工具栏中的对象计数功能，统计 NHF-ATP、TMR 高分子量荧光葡聚糖以及 TMR 低分子量荧光葡聚糖阳性细胞的数量，并通过分析程序将数据导出至电子表格。

本方案旨在对非水解型ATP的细胞内化进行空间、时间和定量分析。通过非水解型荧光ATP与高分子量或低分子量荧光葡聚糖在体外、离体及体内条件下的共定位，证实了非水解型荧光ATP的细胞内化。为确保肿瘤细胞保留内化的ATP，所有瘤内注射至冷冻包埋的实验时间均控制在较短范围内。

同时通过在整个肿瘤内成像组织来考虑肿瘤内的异质性。我们方法的未来改进版本可包括对E-ATP内化过程的实时可视化，揭示巨胞饮动力学及特定组织中物质转运的信息。