使用单细胞荧光成像定量细菌间竞争

该方法旨在通过单细胞水平上细菌菌株间VI型分泌系统介导的接触依赖性竞争来定量分析竞争效应。该技术采用总细胞面积而非细胞计数来量化细菌间的竞争，便于缺乏专有图像分析软件的研究人员使用。该方法可轻松修改，用于定量分析多种可培养微生物之间的竞争。

此外，该实验装置可针对直立式或倒置式显微镜的使用进行优化。首先，通过将2%低熔点琼脂糖溶解于海水PBS中来制备琼脂糖垫溶液。将溶液在微波炉中短暂加热约30秒，并涡旋振荡直至琼脂糖完全溶解。

将此溶液置于55°C水浴中，直至准备使用。接下来，将一条实验室胶带在载玻片上缠绕五圈。在同一载玻片上重复缠绕胶带，使两段胶带之间的距离略小于盖玻片的宽度。

为确保琼脂糖垫表面平整，将温热的琼脂糖溶液滴加在两片胶带之间，并立即盖上盖玻片，使盖玻片与液体接触并排出琼脂糖溶液中的气泡。让琼脂糖垫在室温下固化至少一小时。然后用刀片将琼脂糖垫切割成四个5平方毫米的小块，用于成像。

为准备共孵育的菌株，将每种菌株从冷冻保存液中划线接种至添加了适当抗生素的LBS琼脂平板上，并在24摄氏度下培养过夜。次日，从每种菌株中挑取两个菌落，将其重悬于含抗生素的LBS培养基中。将重悬的菌落于24摄氏度、200转/分钟振荡条件下培养过夜。

次日早晨，将每个生物学重复样品分别接种至1,000倍体积的新鲜LBS培养基中（不含抗生素），培养至菌液在600纳米处的光密度值约为1.5。测定并记录所有样品在600纳米处的光密度值。用LBS培养基稀释各样品，使其光密度值标准化至1。

将两种竞争菌株等比例混合，向已标记的1.5毫升离心管中各加入30微升经标准化处理的菌株。涡旋振荡混合菌液1至2秒。对每个生物学重复和处理组分别混合竞争菌株，共制备四管混合菌液。

通过离心将每种混合培养物浓缩三倍，以确保在共孵育期间具有足够密度的相互作用细胞进行接触依赖性杀伤。弃去上清液，将每种沉淀重悬于20 µL LBS培养基中，并对每个样品进行浓缩处理。若使用倒置显微镜成像，首先将2 µL混合培养物滴加到35 mm培养皿的1.5号盖玻片底部，然后将琼脂糖垫放置在共孵育液滴上方。

在琼脂糖垫上放置一个直径12毫米的圆形玻璃盖玻片。对剩余的三份混合培养物重复进行点样和放置盖玻片的操作，最终得到四个用于成像的培养皿。在继续下一步之前，将载玻片置于实验台面上约五分钟，使细胞沉降到琼脂垫上，以避免成像过程中细胞移动。

首先使用微分干涉差（DIC）显微技术观察细胞，以尽量减少光漂白效应。根据单个细菌细胞的平均大小，采用100倍油镜物镜。针对每个通道，调整曝光时间和采集参数，以实现最低限度的背景信号检测。

选择至少五个视野，并在每个适当的通道中采集图像。打开图像分析软件，导入待分析的图像文件。将图像转换为灰度图，分离各通道，然后对预处理后的图像进行阈值分割，生成二值化掩膜。

选择“分析”，然后从下拉菜单中选择“设置比例尺”，并输入显微镜设置的相应数值。接下来，进入“设置测量”并选择“面积”。在“分析”选项卡下，使用默认设置选择“分析颗粒”。

如果样品中存在碎片，可调整大小或圆形度参数以过滤掉非细胞颗粒。选择“显示”然后选择“轮廓”，以便过滤分析的输出结果包含所有被分析颗粒的编号轮廓。将测量数据导出至电子表格软件，以进行进一步分析和绘图。

展示了每种实验处理的代表性荧光图像。将混合培养物在点样前进行浓缩后，两小时内靶细胞呈现圆形或消失，表明抑制成功。当混合培养物未被浓缩时，细胞在载玻片上保持分散状态。

若细胞间接触不充分，目标菌株不会受到致死菌株的抑制。在拥挤或分散条件下，当目标细胞与VI型分泌系统（T6SS）突变株共孵育时，既未消失，也未变圆。因此，无论何种处理，目标菌株均未受到抑制。

对目标菌株和抑制菌株的颗粒分析结果进行了绘图与分析。在最终时间点，目标区域面积超过初始目标区域面积的100%表示目标菌株净增长，低于初始目标区域面积的100%则表示目标菌株净减少。在所有处理组中均观察到抑制菌株的净生长。

然而，在密集条件下，当野生型抑制菌与靶标共同孵育时，抑制菌初始面积的百分比显著高于所有其他处理组。为了获得清晰的图像，琼脂糖垫应尽可能平整。在将胶带缠绕到载玻片上之前，先将其剪成相同长度的小段，以确保长度一致。