监测表面定植微生物群体中的空间分离现象

本实验的总体目标是利用荧光显微镜观察微生物在群集运动、滑动或生物膜形成过程中的空间分布情况。该方法有助于解答社会微生物学领域中的关键科学问题，例如空间分离如何影响微生物间的相互作用。该技术的主要优势在于，可通过显微镜技术和亚区图像分析，便捷地评估微生物菌株的适应性及其空间分布特征。

演示该实验步骤的是我实验室的博士研究员 Theresa Holscher。在实验前一天，向一支培养管中加入 3 毫升 LB 培养基，并从 B.subtilis 的冻存菌种中接种。对每种感兴趣的菌株，均需使用单独的培养管重复此接种步骤。

将试管放入37摄氏度的水平摇床培养箱中过夜。为准备群集运动和滑动实验用的平板，将20毫升预温的LB培养基倒入90毫米的聚苯乙烯培养皿中。立即盖上皿盖，并将其置于生物安全柜的一侧，静置冷却至少一小时。

接下来，通过将25毫升的双倍SG培养基琼脂倒入90毫米的培养皿中，制备用于菌落生物膜实验的平板。立即盖上皿盖，并将平板以每叠不超过四个的方式堆放，静置冷却至少一小时。实验开始时，将LB琼脂群游和滑行平板放入超净工作台中，打开并移去皿盖。

让平板静置干燥 20 分钟。本实验中平板的湿度至关重要。虽然过多的水分有利于细菌游动，但长时间干燥会抑制群集运动和滑行运动。

类似地，菌落生物膜的结构取决于培养基的干燥程度。使用分光光度计测定过夜起始培养物在600纳米处的光密度。在1.5毫升微量离心管中，将表达绿色和红色荧光蛋白的菌株按密度归一化的量混合，总体积为200微升。

将试管涡旋振荡三秒钟。使用微量移液器，取两微升混合菌液，滴加到超净工作台中预先干燥的90毫米LB琼脂平板中央。将平板放置干燥10分钟。

最后，将平板直立放置于37摄氏度培养箱中孵育，以防止冷凝水积聚在琼脂表面。首先，将两块SG琼脂平板置于超净工作台中静置15分钟，使其干燥。接着，分别取100微升表达绿色和红色荧光蛋白的生物膜菌株——枯草芽孢杆菌168（B.subtilis 168）的种子培养物，加入一个1.5毫升微量离心管中。

将试管涡旋震荡三秒钟。准备含有100微升LB培养基的试管，并利用混合菌液制备一系列10倍梯度稀释的接种液。使用微量移液器，取2微升未稀释的混合菌液，点样至两倍SG琼脂平板上。

依次对10¹、10²、10³和10⁴稀释度的接种物进行相同操作，将接种点均匀间隔，以便在单个培养皿上培养出6至9个菌落。将平板直立置于30°C培养箱中培养1至3天。开始时，将平板放置在荧光检测显微镜的成像平台上。

进行滑动和群集运动实验时，将接种原点（即培养皿中心）置于视野可见区域的角落，以便测量菌落的径向扩展。根据90毫米培养皿中可成像区域的最大范围，调整放大倍数至允许成像的最大分辨率。根据荧光信号的强度，适当调整曝光时间。

进行生物膜分析时，将目标菌落置于视野中央。调整放大倍数至能够完整观察整个菌落的最高分辨率。此时菌落已准备好进行测量与分析。

最后，按照文字实验方案中所述分析数据。该图显示了典型双菌株共接种的枯草芽孢杆菌菌落的生长情况。成群运动是一种依赖鞭毛的集体表面运动，可导致菌群高度混合。

在此延时视频中，初始接种物被放置在平板涂布的中心位置。可以清楚地观察到薄层群集运动现象，随着菌落的发育，红色和绿色荧光标记的菌株呈现出混合且重叠的分布。相反，滑行行为的图像则显示出清晰的生长扇区，分别对应于不同荧光标记的菌株。

本视频展示了两种缺失功能性鞭毛的菌株共接种后形成的滑行菌落的生长过程。这些菌落仍能通过分泌胞外多糖、疏水蛋白和表面活性素的协同作用实现扩散。与具有群游能力的菌株相比，所形成的菌落表现出明显不同的空间生长分布模式。

生物膜形成菌落的起始细胞密度显著影响了最终菌落的空间分布模式。由高细胞密度混合种群起始的菌落，其空间分异不明显或几乎不存在；相比之下，当起始细胞密度较低时，可明显观察到清晰的绿色和红色荧光区域。

观看本视频后，您应能够充分理解如何确定微生物菌落中荧光标记菌株的相对丰度、分析空间分离现象，以及研究奠基细胞密度的影响。