利用噬菌体展示技术开发针对E3泛素连接酶的泛素变体调节剂

噬菌体展示技术不仅有助于我们研究临床重要酶类的结合特性，还能用于开发针对这些酶及其相关疾病的调节剂。噬菌体展示可用于开发针对多种靶蛋白的新型结合分子，且相较于其他传统展示方法更易于操作。该实验流程包含大量重复性操作，因此关键在于避免机械式操作，始终保持专注。

首先，在30毫升的2YT四环素肉汤中接种200微升的种子培养物。在37摄氏度下以200 RPM的转速振荡培养约3小时，直至细菌进入对数生长中期。将平板中的包被溶液弃入水槽中。

用纸巾轻轻吸干。然后向每个包被好的孔中加入 200 µL PB 缓冲液。弃去板中的 PB 缓冲液，并将板放在纸巾上吸干。

向板中每个包被的孔再加入 200 微升 PB 缓冲液。在室温下以 300 RPM 轨道振荡孵育 1 小时。将噬菌体文库置于冰上解冻，然后用 PBS 稀释至文库多样性的 100 倍。

加入聚乙二醇氯化钠溶液，其体积为稀释后文库体积的五分之一，将溶液置于冰上孵育30分钟。接着，在4°C条件下，以11,000 × g离心30分钟。弃去上清液，再离心2分钟，以彻底去除残留的上清液，并浓缩噬菌体沉淀。

将噬菌体沉淀物轻轻重悬于每种待分析靶蛋白对应的1毫升PBT缓冲液中，通常共四种。向对照板的每个包被孔中加入100微升噬菌体文库。在室温下以300 RPM转速振荡孵育1小时。

将靶板中的 PB 缓冲液弃入水槽，并用纸巾将板干燥。将对照板中噬菌体文库的全部 100 微升转移至靶板的每个包被孔中。在室温下以 300 RPM 轨道振荡孵育 1 小时。

接下来，从平板上移除噬菌体文库，并用 PT 缓冲液洗涤包被的孔四次。将平板倒置并在纸巾上轻拍，以去除残留的缓冲液。向每个包被的孔中加入 100 微升 0.1 摩尔的盐酸，以洗脱噬菌体。

将培养板在室温下孵育5分钟，同时以300 RPM转速进行轨道振荡。随后，通过向每个包被孔中加入12.5微升pH为11的1摩尔三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris hydrochloride）来中和pH值。将来自全部八个孔的洗脱噬菌体转移至一个1.5毫升微量离心管中。

转移过程中上下吹打以使溶液均匀，并吸净各孔中的全部液体。向洗脱的噬菌体中加入10% BSA，使其终浓度为1%。将微量离心管置于4摄氏度保存。此为第一轮输出。

通过从琼脂平板上挑取单个大肠杆菌菌落接种至5毫升含四环素的2YT种子培养基中，制备用于下一轮筛选噬菌体输入的种子培养物。在37摄氏度、200转/分钟振荡条件下过夜培养。在第二轮和第三轮的试管中，用适量的磷酸盐缓冲液（PBS）稀释目标蛋白。

取第二轮和第三轮试管内容物的一半，为每个靶蛋白在96孔结合板中包被四个孔，用于下一轮实验。接着，取第一轮产物的一半接种于3毫升对数中期细胞中。在37°C下以200 RPM转速振荡培养30分钟。

加入M13KO7辅助噬菌体，使其终浓度为每毫升10亿PFU。在37摄氏度下以200 RPM的转速振荡培养1小时。1小时后，将全部3毫升培养物转移至30毫升2YT羧苄青霉素-卡那霉素溶液中。

在37摄氏度、200 RPM转速下振荡培养过夜。此处展示的是针对UBE4B的泛素变异体筛选的代表性结果。UBV按频率从高到低排序。

序列代表UBV中泛素区域的多样化部分，包含所有随机化的残基。通过酶联免疫吸附测定（ELISA）测量结合物对野生型靶蛋白、突变型靶蛋白以及非靶向蛋白的相对结合亲和力。所有ELISA吸光度值均相对于96个平均BSA ELISA值和96个平均GST ELISA值进行归一化处理。

颜色较深的绿色表示相对结合能力更强。由于目标蛋白带有 GST 标签，因此将 GST 作为非特异性结合的对照。ELISA 结果在此以图形形式展示。

横轴表示UBVs，纵轴表示相应的归一化吸光度。在进行此操作时，重要的是在加入盐酸后不要丢弃微孔板中的溶液。此时噬菌体已悬浮在溶液中，需保留这些噬菌体，以便进行后续富集、最终分析或两者同时进行。

完成此操作后，应进行测序以确定UBV的频率。可进行ELISA和IC50实验，分别测定UBV的结合效力和抑制效力，并协助确定需进一步表征的UBV。