使用重组蛋白诱饵进行噬菌体展示与亲和筛选的实验方案

本实验的总体目标是发现与固定化诱饵分子相互作用的蛋白质。首先获取并固定诱饵分子，随后在促进结合的条件下，将待筛选的噬菌体文库引入诱饵中，从而实现这一目标。

接下来，通过严格的洗涤步骤去除未结合的噬菌体。而结合的噬菌体则用于感染细菌，随后进行回收。最后一步是扩增已结合的噬菌体，以用于下一轮亲和筛选。

最终，当噬菌体滴度达到平台期时，选取单个噬斑进行测序，以确定在实验结合条件下对固定化的靶标蛋白具有最高亲和力的蛋白质。该过程有助于解答蛋白质-蛋白质相互作用中的关键问题。本实验步骤始于将纯化的重组蛋白按照文本方案中的描述加入到微孔板的孔底。

下一步是在250毫升锥形瓶中加入50毫升含100微克/毫升氨苄青霉素的Luria burani培养基，并接种一个此前已按文本方案培养的单菌落，在37摄氏度、200转/分钟的水平摇床中培养，使用分光光度计监测细胞密度，直至600纳米处的光密度达到0.5至0.6。然后将菌液倒入50毫升Falcon管或其他类似容器中，4摄氏度保存备用，细胞通常可保持活性约一周。在第一天进行此操作。在第二天早晨，按照文本方案准备亲和筛选实验。

将九个已灭菌的250毫升锥形瓶放入恒温摇床的夹具中，用前一晚接种的噬菌体感染的BLT5403细胞过夜培养物中的500微升接种500毫升LAL布罗尼培养基。将锥形瓶放入培养箱后，打开分光光度计并设置为在600纳米处读取吸光度。同时，从4摄氏度取出微孔板，揭去塑料封膜。每孔加入200微升1×Tris缓冲盐水（TBS，pH 7.5），洗涤10次以去除未结合的蛋白质，每次洗涤之间将微孔板倒扣在纸巾上轻拍。

每孔加入 200 µL 含 5% 封闭试剂的 TBS 溶液，室温封闭 1 小时。用封口膜包裹微孔板，用 200 µL 1×TBS-T 溶液洗涤 10 次，每次将微孔板倒扣在四层纸巾上，两次洗涤之间用纸巾吸干残留液体。

此后，使用带滤膜的吸头以避免噬菌体交叉污染。将100微升噬菌体文库加入蛋白质中。用塑料封口膜重新密封培养板，并在室温下孵育1小时。

一小时结束后，从培养板上取下封口膜，并立即通过振荡将噬菌体移至生物危害废物中。然后使用多通道移液器迅速向每个孔中加入 200 µL 的一倍 X-T-B-S-T，同时设置计时器为一分钟。

一分钟后，将缓冲液倒入生物危害废物容器中，将酶标板倒扣在纸巾上轻拍，然后放回实验台。在第10次洗涤后，重复洗涤步骤10次。从4°C的50毫升离心管中取出200微升BLT 5 4 0 3细胞，加入到已去除最后一次洗涤液的9个孔的底部。

用塑料膜包裹平板，置于 37 °C 环境中 20 分钟，使仍吸附在诱饵上的任何噬菌体在 20 分钟结束时感染细菌。揭开平板的塑料膜。接下来，从 25 °C 的 BSA 复制孔一中取出 10 µL 细菌，转移至标记为一的 990 µL 培养基中。

对该孔再重复此过程两次，最终得到该孔噬菌体1至100倍稀释液的三个重复样本，即BSA第一次复制，每个样本取三次重复。这些稀释液将用于估算该次BSA复制的平均滴度及其标准误。对BSA的第二次和第三次复制、毒化诱饵蛋白的三个重复孔以及诱饵蛋白组同样进行相同操作。将这27个EOR离心管放置一旁备用。若烧瓶中的细菌光密度值处于0.6至1.0之间，将50毫升菌液从锥形瓶中倾入每个250毫升的三角烧瓶中，共9个。

取BSA复制一孔中剩余的170微升噬菌体感染的BLT 5 4 0 3细菌，加入标记为BSA rep.One的50毫升细胞中。在将所有九个孔的溶液都进行此操作后，将锥形瓶置于37摄氏度培养箱中振荡培养。同时，从最初的27个稀释样品开始进行稀释操作：取Einor管1中含细菌的LB培养基100微升，加入Einor管中900微升的LB培养基中。

对于10的负3次方稀释度，取四个样本，在从eppendorf管四中吸取100 µL含细菌的LB培养基并加入eppendorf管七的900 µL LB培养基之前，需将滤芯吸头更换为新的。对于10的负4次方稀释度，继续对所有蛋白质及处理组的所有重复样本进行梯度稀释。待细胞裂解后，总共应有135个离心管。

加入5毫升5摩尔/升的氯化钠储备液，将培养物调至0.5摩尔/升氯化钠浓度，然后将样品转移至已标记的离心瓶中，在4摄氏度下以8,000 × g离心10分钟。随后将含有病毒的上清液倾入干净无菌的50毫升Falcon离心管中。向Falcon管中倾出的上清液加入几滴氯仿。

上清液可在4°C下保存，用于第三天的下一轮亲和筛选。将250 µL VLT 5 4 0 3细胞从4°C取出，用移液器加入之前准备好的编号硼硅酸盐试管中。然后从爱诺管一的稀释液中吸取100 µL，加入硼硅酸盐试管一中的250 µL细胞中。将移液器前五英寸部分短暂地在火焰上加热，然后插入熔化的顶部树脂中。

吸取三毫升并迅速加入含有细胞和噬菌体的试管中。用一只手握住试管，另一只手轻弹混匀，然后将内容物倒入培养皿中。倾斜培养皿，并用试管驱赶气泡和干燥区域，直至顶层琼脂完全覆盖整个培养皿表面。

将其直立放置在实验台上冷却。丢弃硼硅酸盐管。弹出滤膜屏障吸头，更换新的吸头，并继续操作，直至所有稀释液均完成接种。

从培养箱中取出已准备好的平板，随用随取，每次不超过六个，以免平板冷却过快导致顶层琼脂过快凝固。观察平板上形成的噬菌斑，弃去出现完全裂解的平板。确定剩余的系列稀释样品中哪些产生的噬菌斑数量足够少，以便进行准确计数。记录这些平板上的噬菌斑数目，并按照亲和筛选末尾文本方案中所述方法计算滴度。第四轮：使用无菌黄色吸头挑选18个形态清晰、独立的噬菌斑克隆。

在离心管中用 pH 8.5 的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris hydrochloride）润湿枪头内壁。然后通过将枪头穿过滴定板上分离良好的噬菌斑，直接插入下方的塑料培养皿中，吸取噬菌斑核心，并将芯部排入相应试管中含 100 µL pH 8.5 的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液中，随后涡旋混匀。简要地，从此溶液中取 20 µL 在 65°C 加热 10 分钟，然后按照本文所示文本方案进行 PCR 和测序。通过多次取样获得的典型滴度结果表明，最终估算值对移液误差的敏感性较低，因而能更准确地反映实际滴度及其周围变异情况。

随着亲和筛选轮次的增加，非中毒诱饵孔中的噬菌体滴度显著升高，表明孔间估计结果良好，同时也验证了该技术的有效性。随着亲和筛选轮次的增加，非中毒诱饵孔中携带插入片段的噬菌体所占比例逐步上升，此现象在多轮亲和筛选后尤为理想。

与第一轮相比，插入片段的独立回收噬菌体数量增加，且这些扩增产物集中在少数大小相同的条带上，这表明在亲和筛选过程中特定克隆正在被富集。可通过其他方法（如酵母双杂交实验）进一步验证噬菌体展示技术所发现的分子相互作用。