通过肿瘤大体解剖富集肿瘤成分

福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织通常是肿瘤组织与非肿瘤组织的混合物，其中非肿瘤成分的存在往往是不希望的，若比例较高，会显著影响基因组分析的结果。因此，与使用未切割组织相比，宏观解剖（macro-dissection）的主要优势在于，可以获得去石蜡的切割组织切片用于RNA和DNA提取，并可将其可靠地应用于后续的基因组分析，确保所提取的材料来源于肿瘤成分富集且非肿瘤组织污染极少的组织。本流程的多步骤操作将由Lee Wisner先生、Brandon Larsen博士和我本人进行演示。在进行组织切片前，需将石蜡包埋块在冰水中预浸泡10至15分钟。

将包埋块冷却可使石蜡硬化，同时水分使组织软化，二者共同作用使得切片更易进行。在包埋块置于冰上时，应正确标记显微镜载玻片。将水浴锅加水并加热至39摄氏度，并将切片机调节至所需的切片厚度。

小心地将刀片安装到切片机上。将刀片固定到位，并将安全护罩升起，直到准备开始切片蜡块时再放下。在安全护罩就位的情况下，将福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织块插入切片机的夹持器中。

首先缓慢切片，直至获得一个完整的切面，此过程称为修块。完成修块后，即可加快切片速度，以获取连续的切片带。

切下后，将组织切片带转移至温水浴中。用镊子将单个组织切片从切片带上分离。操作时，将闭合的弯头镊子背面置于两个切片连接处，轻轻打开镊子以分离切片。

将分离的组织切片收集到载玻片上。为避免产生气泡，应将载玻片以倾斜角度插入水中。轻轻晃动载玻片以去除多余水分，然后置于支架上晾干。

干燥后，选取至少一张新切割的组织切片进行苏木精和伊红染色（也称为H和E染色）。染色完成后，将H和E染色切片送交病理科进行病理学评估。在病理学评估过程中，专业病理学家会通过观察H和E染色切片，确定每张组织切片中目标组织所在的位置。病理学家首先会整体评估组织，以确定目标组织在组织中的具体位置。

完成初步的组织学和形态学评估后，病理学家使用切片标记笔在每张苏木精和伊红（H&E）染色切片上进行标注。使用标记笔，病理学家在目标组织周围画出圈注，排除非目标组织区域。此评估过程随后在项目中的所有H&E染色切片上重复进行。

设置大体解剖工作台，确保能够依次高效处理每个样本。每个样本均需备好经病理学评估的苏木精和伊红（H&E）染色切片、相应的未染色组织切片载玻片，以及预先标记并装有消化缓冲液用于组织收集的微量离心管。将未染色切片装入玻片架中，随后转移至通风橱进行脱蜡。

将切片浸入未稀释的D-柠檬烯或CitriSolv中，连续清洗两次，每次清洗后用100%乙醇最终清洗两分钟。每次清洗开始时，轻轻振荡约5至10秒。为尽量减少清洗步骤间的残留，让切片架短暂沥干，并在纸巾上轻拍切片架以吸除多余液体。

经过三次洗涤后，组织在显微镜载玻片上已清晰可见。将载玻片室温晾干10分钟。干燥后，将H和E染色切片正面朝下放置于实验台面上，再将脱蜡组织切片同样正面朝下放置于其上，使脱蜡组织与H和E染色切片对齐。正确对齐后，用笔在脱蜡组织切片的背面描出病理医生在H和E染色切片上标记的肿瘤区域。

现在将已标记但未染色的载玻片浸入3%甘油溶液中，以减少静电并有助于组织收集。将浸入的载玻片缓慢取出，以尽量减少附着在载玻片上的甘油溶液量。取出后，擦拭载玻片背面以及载玻片正面无组织的区域，以去除多余的甘油。

接下来，使用干净的刀片沿病理标记划线，切断目标组织与周围其他组织之间的连接。需要注意的是，此步骤可在浸入甘油之前进行，特别是当病理标记较为复杂时，因为在干燥状态下切割组织更容易，并且可以最大限度地减少组织拖拽的风险。病理标记以外的组织无需保留。

使用刀片的平边去除这些组织，注意使刀片的角勾住病变标记的外缘。一旦去除不需要的组织，即更换新刀片以采集目标组织。采集到的组织随后用木棒的平头从刀片上刮下，并转移至预先标记好并含有消化缓冲液的微量离心管中，由此完成通过大体解剖介导的肿瘤组织富集，所得样本现已可用于核酸提取。

为了说明宏观解剖如何影响下游基因组分析，研究人员选取了五例肿瘤含量不同的弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）组织切片，分别进行宏观解剖或不进行宏观解剖。对收集的组织进行核酸提取，并利用DLBCL90数字基因表达谱分析法（又称“双打击”特征分析法）检测所获得的RNA。DLBCL包含三种不同的分子亚型，即GCB型、ABC型以及介于两者之间的未分类亚型，这些亚型可通过DLBCL90分析法确定。

该检测还可识别携带涉及 BCL2 基因的双重打击易位的 DLBCL 肿瘤。DLBCL 90 的结果如本表所示。宏分离样本进行了两次检测。

一次使用其RNA储存液的原始浓度，另一次将RNA储存液稀释至与其相应的非大体解剖样本浓度一致。结果显示，在五个样本中有三个样本的大体解剖导致了亚型或双打击分类结果的改变。样本A的大体解剖对其亚型分类结果无影响，但使其双打击分类从阴性变为未分类，且该变化在无论使用何种RNA输入量的宏解剖样本中均被观察到。

相比之下，样本C的宏观解剖对双打击判定无影响，但使亚型判定从GCB型变为未分类型，且该结果在不同宏观解剖样本RNA输入量下均一致观察到。与样本A类似，样本E的宏观解剖对亚型判定无影响，但改变了双打击判定结果；然而，对于样本E，其判定结果由未分类型转变为阴性，且同样不受宏观解剖样本RNA输入量的影响。

值得注意的是，将该样本重新分类为双打击阴性在生物学上是合理的，因为样本E被确定为ABC型，而涉及BCL2的双打击易位据文献报道仅见于GCB型肿瘤。综上所述，这些结果凸显了肿瘤纯度、基因组检测以及大体解剖作为实现高纯度肿瘤样本可靠工具的重要性。观看本视频后，您应对大体解剖的定义、病理学评估的重要性，以及将大体解剖纳入组织处理流程所能带来的研究优势有更深入的理解。