利用质谱成像技术分析福尔马林固定石蜡包埋组织样本以拓展对肿瘤微环境的理解

这些方案能够实现单细胞分辨率下的定量分析、标志物共表达检测，以及利用福尔马林固定石蜡包埋和新鲜冷冻组织样本进行特殊分析，以阐明免疫细胞在癌症中的作用。该技术是一种强大工具，可在单张组织切片上同时对多达40种标志物进行表征，并能广泛保留样本中组织的结构完整性。关键步骤在于抗体的优化与验证。

若未完成此步骤，可能导致图像质量低下，从而影响获得高质量、可重复的数据和结果。首先将所有含抗体的离心管在 10,000 × g 下离心 5 分钟，然后将各自的抗体加入封闭缓冲液中并充分混匀。移液时切勿触碰抗体管底部。

通过加入100微升封闭缓冲液预润湿0.1微米离心过滤装置，对抗体 panel 进行过滤。在10,000 × g 条件下离心两分钟，然后用移液器移除穿流的封闭缓冲液。随后将抗体 panel 转移至离心柱中，在10,000 × g 条件下离心两分钟。

弃去离心柱，使用滤过液作为过滤后的抗体组合。进行抗体染色时，将每张玻片侧向倾斜，轻轻敲击边缘以吸水纸去除封闭缓冲液。将玻片置于湿盒中，并向组织上加入 100 至 200 微升抗体主混合液。

将阳性和阴性对照切片加入染色批次中，并在 4 摄氏度下过夜孵育。启动仪器时，登录控制软件，如果仪器处于睡眠模式，请点击“唤醒”（Wake Up）。点击“更换样本”（Exchange Sample）以加载切片，然后点击“继续”（Continue）打开舱门。

将载玻片放入加载槽中，样本面朝上，标签位于右侧，点击“继续”关闭舱门。选择项目，然后为加载的样本选择载玻片名称。在视野（FOV）选择的载玻片光学图像窗格中查看全景图像，点击“模式”菜单并选择二次电子探测器，然后点击“成像模式”菜单并选择QC 300微米。

单击“Jog Stage”以控制视野（FOV）位置，然后单击箭头导航并选择FOV的位置。单击“添加FOV”，将视野大小设置为400微米×400微米，成像模式选择“Fine”，停留时间设为1毫秒，然后单击“确认”。创建FOV列表后，进入图像对焦步骤，将电子束移至不用于成像的组织区域，以调节消像散。

调整参数直至获得清晰的中心图像，然后单击“开始运行”。采集的图像将自动上传并存储在基于网络的图像管理应用程序中。此处显示的矩阵描述了由探针纯度和氧化物引起的串扰百分比。

此处蓝色方框表示串扰大于或等于0.5%，透明方框表示串扰小于0.5%。对于质量标签，显示了对零个通道、一个或两个通道、或超过两个通道产生至少0.5%串扰的探针。同时也展示了来自零个探针、一个或两个探针、或超过两个探针产生至少0.5%串扰的质量通道。

此处展示了肺腺癌、非肿瘤性肾脏和扁桃体等不同组织的代表性染色图像。本图显示了使用该技术染色的扁桃体组织切片，经第三方数字图像分析软件在未进行滤波和校正前的可视化结果。同一组织切片在相同条件下，经过滤波和校正步骤后的图像也在此展示。

该方法可生成图像，用于上传至第三方数字图像分析软件，从而进行包括组织区室化、细胞分割、标志物共表达以及邻近分析和远距离分析在内的全面分析。通过研究可获得高度多重成像方法。通过构建不同的检测面板，研究人员可对癌症、正常、副肿瘤、炎症及感染性样本进行研究。