视网膜静脉阻塞小鼠模型的优化以减少变异性的研究

该方案提供了一种无创研究血管损伤及其继发性水肿发生机制的模型。该技术的主要优势在于，无需手术干预即可实时动态观察损伤过程，从而为更高效地测试治疗方法提供了途径。

学习如何正确进行尾静脉注射以及如何将动物正确安置在平台上可能会具有挑战性。对于这两种技术，我建议保持耐心，逐步操作。首先，轻柔地操作光纤电缆，将其连接到激光控制盒和视网膜成像显微镜的激光适配器上，然后打开视网膜成像显微镜的灯箱。

打开计算机并启动成像程序。将一张白纸放在显微镜目镜前方，通过点击成像程序中的“Adjust”按钮来调节白平衡。转动钥匙以打开激光控制箱，并根据激光控制箱屏幕上的指示进行操作。

为验证激光器的基线功率，将激光控制盒设置为 50 毫瓦和 2,000 毫秒。然后打开激光器，并将功率计置于目镜前方。踩下脚踏开关以激活激光，使激光功率读数达到 13 至 15 毫瓦。

然后，使用激光控制箱的屏幕，将实验用激光功率调节至100毫瓦和1,000毫秒，并关闭激光。将300毫升水倒入500毫升烧杯中，并将烧杯放入微波炉加热一分钟。随后将纱布浸入温水中。

接下来，将一只两个月大的雄性小鼠放入固定器中。用温热的纱布轻轻按压小鼠尾巴，观察扩张的静脉。使用26号针头，根据动物体重注射适量的玫瑰红染料，并在擦拭注射部位前对注射部位施加压力，以防止血肿或出血。

然后将小鼠从固定器中释放并放回笼中。玫瑰红染料循环8分钟后，再注射麻醉剂。打开小鼠加热平台。

然后在小鼠的每只眼睛中各滴加一滴去氧肾上腺素和托吡卡胺。确认麻醉成功后，每只眼睛滴加一滴盐酸丙帕卡因，随后在两只眼睛上均涂抹眼膏。接下来，在耳间皮下注射150 µL卡洛芬。

然后将小鼠安置在平台上，调整平台位置，直至眼底视野清晰且对焦准确。计数视网膜静脉，并拍摄眼底图像。接着，打开激光，瞄准距视神经乳头约375 µm处的视网膜静脉。

通过踩下脚踏开关照射血管，并轻微移动激光束至最多100微米。重复此步骤三次，每次脉冲后移动激光束，使照射区域不集中于一点。在其他主要血管上重复照射，以实现两到三个闭塞点。

照射血管后，关闭光源并等待10分钟。然后重新打开光源，计数闭塞的静脉数量，并拍摄眼底图像。在获取图像并注射生理盐水后，向双眼滴加润滑眼药水和凝胶眼膏。

观察小鼠从麻醉中恢复的过程，只有在完全恢复后才能将其放回与其他动物共用的笼子中。在玫瑰红染料注射后10分钟和20分钟进行激光照射的小鼠，其激光照射后即刻形成的阻塞数量并无差异。在视网膜静脉阻塞后长达一天的时间内，无论基因型如何，在玫瑰红染料注射后20分钟进行激光照射的小鼠所维持的阻塞数量显著减少。

在不改变实验功率（100毫瓦）的情况下，11.5毫瓦的低基础激光功率未导致任何闭塞。相比之下，13.5毫瓦的基础激光输出则成功诱导了血管闭塞。激光光凝术后可出现四种主要类型的血管闭塞：完全闭塞的血管、部分闭塞的血管、部分再灌注的血管和完全再灌注的血管。

与C57 Black 6小鼠相比，他莫昔芬诱导的内皮细胞Casp9基因敲除小鼠的受照射血管在部分再灌注和部分阻塞状态下的持续时间更长，而C57 Black 6小鼠则更多处于完全阻塞状态。激光光凝损伤后前10分钟内，血管的阻塞状态迅速变化，损伤后24小时可观察到火焰状出血。视网膜静脉阻塞后出现了不同的眼科病理改变。

视网膜静脉阻塞后视网膜水肿的程度可通过光学相干断层扫描图像对受损眼进行定量评估。通过评估视网膜内层的结构紊乱情况，还可确定神经元层的状态。下图显示了一例光学相干断层扫描图像，并标注了各层对应的名称。

测量激光的基线功率非常重要。该读数将极大地影响阻塞实验的成功率，并可进行优化。还可进行其他方法，如OCT、ERG和Optiger。

这将有助于阐明神经血管损伤对视网膜神经元完整性和视觉通路功能的影响。该技术为研究驱动神经血管疾病的分子通路提供了途径，并且通过长期追踪单个动物，可获得更易于转化为人类疾病研究的数据。