用于基于计算机断层扫描的小鼠后肢血管三维可视化的样本制备
2021年10月7日
本文介绍了一种利用微型X射线计算机断层扫描技术对小鼠后肢血管进行可视化和定量分析的方法。
可以使用步进式方案对下肢和腹部器官的血管进行CT成像。该方法能够全面评估全部血管。此外，可仅评估动脉，或同时评估动脉和静脉。
防止血液凝结、渗漏或出血过多，并避免产生气泡，这一点非常重要。手术前，将1单位/克的肝素溶于PBS中，注射到小鼠腹腔内。30分钟后，对已处死的小鼠在胸骨处做正中切口，并用针固定打开的胸腔。
在取出心脏前，剪断升主动脉，然后移除肺以暴露降主动脉。斜向剪断降主动脉，以显露血管的横截面。接下来，在灌注血管扩张缓冲液的同时，将一根22号导管插入降主动脉。
固定导管根部并打结，以防止因反流导致的泄漏。完成后，在13至15千帕的恒定压力下，开始用预热的血管扩张溶液进行灌注。3分钟后，用含4%多聚甲醛的PBS溶液灌注3分钟。
停止灌注，并用2 mL新配制的对比剂（以1:1比例稀释）充满连接至导管的延长管，以13至15千帕的恒定压力进行灌注。为观察动脉，检查口部脚趾甲处，确认对比剂已到达动脉。同样，检查膈肌处的下腔静脉，以确认对比剂完全循环，并显示所有血管。
如果造影剂循环完全，关闭三通旋塞并移除导管。将样本在4摄氏度下孵育过夜。在本方案中，小鼠下肢的所有血管均得到可视化。
后肢缺血模型的结果证实，未结扎的股动脉与股静脉平行走行。此外，造影剂在中断处清晰显示了结扎的股动脉以及侧支血管的形成。可观察到少数血管充盈造影剂。
另一方面，由于非对比剂的混入或灌注不足，对比剂的分布也出现中断现象。通过显微或体视显微观察对比剂时，无法清晰观察到体表的动脉，这反而更有利于评估血管系统的缺陷。插管时必须注意避免产生气泡。
由于它们的腹部器官也处于松弛状态，因此可以取出器官并进行CT扫描。通过使用这种方法，我们能够识别出一个新的饱和区域。
概述
本文介绍了一种利用微型X射线计算机断层扫描技术对小鼠后肢血管进行可视化和定量分析的方法。该技术可实现对下肢及腹部器官血管的全面评估。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 血管生物学
- 成像技术
背景
- 微型X射线计算机断层扫描是一种强大的成像工具。
- 了解血管结构对于多种生物学研究至关重要。
- 以往的方法可能无法提供全面的可视化效果。
- 本研究旨在改进小鼠模型的可视化技术。
研究目的
- 建立一种可靠的后肢血管可视化方法。
- 实现对小鼠模型中血管结构的定量分析。
- 评估干预措施对血管健康的影响。
使用的方法
- 注射肝素以防止血液凝固。
- 灌注造影剂以显示血管结构。
- 通过CT成像获取详细的血管结构图像。
- 评估后肢的动脉和静脉。
主要结果
- 成功实现下肢所有血管的可视化。
- 在后肢缺血模型中识别出侧支血管。
- 观察到存在气泡和灌注不完全的挑战。
- 该方法可用于评估血管缺陷。
结论
- 该方法为血管成像提供了一种全面的途径。
- 它可加深对小鼠模型中血管状况的理解。
- 未来应用可能包括对血管健康与疾病的研究。
常见问题
行业重要性概述
该方法可实现小鼠血管网络的全面三维可视化，有助于对血管生成反应和血管病理进行临床前评估。通过提供来自后肢和腹部器官血管系统的定量结构数据，该方法增强了在血管生物学和缺血性疾病模型中的靶点验证能力。该技术通过减少对二维切片的依赖，并实现对血管结构和侧支形成的直接观察，提高了先导化合物筛选的预测可靠性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：可在缺血模型中探究与血管生成及血管重塑相关的治疗假设。
- 操作价值：通过直接进行三维成像观察灌注缺损和侧支循环的形成，实现对血管靶点的功能性验证。
- 预测价值：通过量化药物或遗传干预下的血管反应，支持研究项目的优先筛选与决策。
筛选与检测方法开发
- 检测准备：通过建立基线血管形态，为下游化合物筛选准备标准化的生物系统。
- 定量输出：提供可测量的血管参数，如血管密度、分支模式和灌注完整性，用于检测标准化。
- 可扩展性：兼容微计算机断层扫描（micro-CT）平台，可在不同实验室和研究场所实现可重复成像。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：在后肢缺血中模拟生理性和病理性血管生成，支持转化生物标志物的比对。
- 临床前连续性：通过实现纵向血管评估，将发现阶段的研究结果与临床前验证相衔接。
- 基于风险的决策：通过可视化影响药物疗效的血管缺陷及代偿机制，为推进或终止决策提供依据。
流程与工作流整合
该方法适用于从发现到临床前研究的连续流程，特别是在靶点验证和先导化合物优化阶段，此时血管表型是关键的读出指标。
- 发现生物学：支持在疾病模型中对血管生成通路和血管完整性的假设验证。
- 筛选：提供可直接用于检测的血管模型，具有可重复且定量的成像输出，适用于化合物评估。
- 分析：提供基于结构和灌注的读出指标，可在不同实验条件下进行比较分析。
- 转化研究：将分子层面的发现与临床前模型中的血管结局相关联，支持与生物标志物关联的疗效评估。
- 企业级复用：建立可重复使用的成像平台，用于多个治疗领域的血管表型分析。
运营与企业影响
- 科学价值：通过降低血管反应机制的不确定性，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：通过标准化灌注与成像方案，增强实验的可重复性与标准化水平。
- 战略价值：通过实现对血管相关风险的早期识别，减少后期研发失败，提升资本使用效率。
- 项目组合影响：基于定量的血管形态学与灌注数据，支持经风险调整的研发推进决策。
实施注意事项
- 需要具备显微外科血管灌注和对比剂操作的专业技术。
- 依赖于微型计算机断层扫描（micro-CT）成像设施以及对比剂配制能力。
- 为获得可重复的结果，需在不同团队间对灌注压力、灌注时间及对比剂稀释度进行标准化。
- 在不同模型系统间应用时，可能需要调整插管技术和灌注参数。
- 实际操作中的局限性包括对气泡的敏感性、灌注不完全以及对比剂混合等问题，这些均可能影响成像质量。
