利用计算机断层扫描和光学成像技术研究颅骨自体移植与异体移植中成骨-血管生成偶联以评估骨整合

本实验的总体目标是通过多模态成像方法，监测颅骨移植骨在骨再生和新生血管形成方面的整合情况。该方法有助于回答再生医学领域中的关键问题，例如成骨与血管生成之间的偶联关系。该技术的主要优势在于能够高分辨率地三维确定血管网络结构，并可对完整器官进行研究。演示本实验操作的是我实验室的博士研究生 Doron Vic，在处死7至8周龄的Bab海鼠后进行。

根据文字方案，使用毛发修剪器逆着毛发生长方向剃除颅骨区域的毛发。用70%异丙醇擦拭尸体头部以消毒。然后使用11号手术刀切开头皮，并使用牙科钻和内径为4.5毫米的齿状工具去除骨膜。

分离一块圆形的颅骨骨片。将骨片转移至含有无菌生理盐水的100毫米塑料培养皿中。此时，使用弯头镊子观察附着在骨片上的血液和软组织。

每次取一个骨碎片，用棉签彻底擦拭，去除任何脑组织、软组织和血液。使用精细剪刀轻轻剪除仍附着在移植物上的骨碎片，使移植物呈现完美的圆形。

将每个移植物先浸入含有70%乙醇的15毫升离心管中一次，再浸入含有PBS的15毫升离心管中两次，以洗去乙醇。将同种异体移植物放入冻存管中，在-80°C超低温冰箱中冷冻至少一周。在使用表达荧光素酶的受体转基因小鼠时，需确保移植物在骨钙素启动子调控下呈透明状。

使用注射用麻醉剂对一只7至8周龄的雌性小鼠进行麻醉，并确认其进入镇静状态后，逆着毛发生长方向使用毛发剪刀剃除颅骨区域的毛发。涂抹脱毛剂以去除残留的毛发，两分钟内用干纱布擦去脱毛剂。

然后用生理盐水浸湿的纱布擦拭该区域。使用5%氯己定皮下消毒头皮。将每千克5毫克的卡洛芬溶于200微升生理盐水中后注射。

涂抹眼膏以防止角膜干燥，并始终将动物置于加热垫上。然后将动物置于手术显微镜下。接着，使用精细剪刀和镊子，用镊子夹起头皮皮肤，剪出一个长约1厘米的椭圆形切口。

握住骨膜，使用精细剪刀配合牙科钻和外径为五毫米的精修钻，在顶骨上制作缺损，位置位于人字缝前方两毫米处，以避免穿透硬脑膜。钻至骨厚度的四分之三深度，然后用刮匙分离骨碎片。该实验方案中的一个关键步骤是准确确定缺损的位置。

损伤矢状缝将导致大出血。因此，应小心避免破坏下方的硬度计和上矢状窦。以植入自体移植物。

使用10毫升无菌生理盐水在10毫米塑料培养皿中冲洗骨碎片。去除血凝块但保留软组织，提前将同种异体移植物解冻，并将样本恢复至室温。然后用弯头镊子冲洗骨碎片。

将骨移植物置于缺损处，确保其不接触缺损边缘。随后使用纤维蛋白凝胶将移植物黏附于宿主骨上。用4-0薇乔缝线缝合皮肤，并在手术切口处涂抹聚维酮碘。

标记小鼠耳朵，并注射0.25毫克/千克抗镇静剂。为逆转麻醉剂的作用，按照文本方案进行术后护理。

通过称取2000单位的肝素钠并转移至50毫升离心管中，制备肝素化生理盐水。向管中加入20毫升无菌生理盐水并振荡混匀。用15毫升预温的肝素化生理盐水充分填充一支20毫升螺口注射器，并将该注射器连接至23号头皮静脉输液套管。

将注射器连接至注射泵，并将泵设置为以每分钟1毫升的速度输注10毫升。根据文本方案对小鼠进行麻醉后，通过脚趾夹捏法确认其镇静状态，并将小鼠仰卧位固定于覆盖有吸水衬垫的固定板上。

接着，从腹部向颈部切开皮肤。沿腹壁切开至剑突处。然后沿肋骨的侧面剪开肋骨笼，确保完全暴露心脏，且不损伤心脏和肺组织。

使用止血钳牵开胸骨。将蝶形针插入左心室3毫米处，然后用三秒胶将针固定于心脏和胸壁。将蝶形针插入左心室是一项精细的操作。

应避免插入右心室或过深地插入左心室，以免穿透心脏后壁。接下来，立即启动泵。一分钟后，解剖下腔静脉以降低血管压力。

将板子倾斜，使液体从头部流走。成功的灌注将导致肝脏和血管变得透明。现在灌注10毫升4%甲醛。

避免气泡进入血管系统。当灌注完成，尾部变僵硬时，用10毫升肝素化生理盐水冲洗出甲醛。按照制造商的说明制备放射性不透光对比剂。

将化合物稀释剂与固化剂在塑料管中混合，以每分钟1毫升的速率向动物灌注造影剂。当灌注完成时，冠状动脉、肠系膜动脉和肝动脉应变为黄色。剪断通向蝶形针的导管，并用纸包裹尸体，以防止溶液泄漏至颅骨区域。

将动物置于 4 摄氏度环境中过夜，以使聚合反应在次日完成。为解剖颅骨区域，使用手术刀尽可能向侧方切开皮肤，避免损伤感兴趣的颅骨区域。定位骨移植部位后，使用精细剪刀在距离移植部位 10 毫米处剪除颅骨。

使用微型CT扫描仪。将视野设置为20.5毫米，X射线能量为55 kVp，强度为145微安，每360度采集1000个投影，积分时间为200毫秒。对分离的颅骨骨样本进行扫描。

观察由显微CT软件生成的二维重建切片。确保正确扫描感兴趣区域，然后定位颅骨缺损。如果灌注的血管易于识别，则使用6%三氯乙酸溶于双蒸水中的溶液。

为了对样本进行脱钙处理，使用与上述相同的参数重新扫描样本。在重建的二维切片中定位人字缝。定义一个高为两毫米、直径为八毫米的圆柱形感兴趣体积（VOI），使其与人字缝相切。

这是缺损的解剖部位。接下来将骨组织与软组织进行分割。将下限阈值设为130，并应用约束性3D高斯滤波器，以部分抑制容积中的噪声。

生成三维重建图像。使用IPL软件和DT对象确保VOI准确定位。通过Peram功能生成厚度图。

该功能描述了每种血管直径下的血管体积，并通过成像和微型计算机断层扫描进行检测。根据此处所示的文本方案，术后七天，CT 扫描显示，接受自体移植的小鼠中滋养整个移植物区域的小型和中型直径血管体积显著高于接受异体移植的小鼠，后者血管似乎从外部渗透进入。此外，荧光成像显示，接受自体移植处理的动物其血液灌注显著更高。

术后第14天，异体移植物中的血管系统已延伸至移植物的全部邻近区域。然而，其血管体积显著低于自体移植物组。当比较直径为0.08至0.1毫米的血管时，这一差异最为明显。如图所示，在术后28天，血管体积在术后7天恢复至基线水平。

通过使用靶向羟基磷灰石的探针进行荧光成像可见，自体移植组表现出显著更高的骨矿化程度。在该组中，骨组织在整个移植物周围形成，而在同种异体移植组中，骨组织仅在术后56天时于缺损边缘形成，呈环状分布；接受自体移植的动物其骨体积显著更高，移植物厚度也显著更大。一旦掌握该手术技术，整个操作可在约25分钟内完成。在本实验流程之后，可采用其他探针进行荧光成像，以回答更多科学问题，例如破骨细胞活性及免疫反应的参与情况。

观看本视频后，您应能充分理解如何对骨再生过程中的基础血管生成进行成像。