基于显微镜的检测方法用于通过SNARE运输研究和分析循环内体

基于显微镜的检测方法，用于利用SNARE运输来研究和分析再循环内体。这些是皮肤黑色素细胞。你所看到的细胞内呈黑色的细胞器被称为黑色素体。

黑素体是一类被称为溶酶体相关细胞器（LRO）的细胞器。再循环内体是所有细胞类型中由早期或分选内体形成的管状囊泡状细胞器。这些细胞器在黑素细胞产生的溶酶体相关细胞器——黑素体的生物发生过程中发挥关键作用。

回收内体在黑色素体形成过程中将黑色素细胞特异性货物运送至未成熟黑色素体。在多种综合征中可观察到回收内体的生成，导致皮肤、毛发和眼睛的色素沉着过度。因此，研究回收内体的动态变化有助于理解这些细胞器在正常及疾病状态下的功能。

本研究旨在通过抑制SNARE蛋白syntaxin-13来测量回收内体的动态变化。第一步是在预处理的盖玻片上接种小鼠黑素细胞。将玻璃盖玻片置于培养皿中，用基底膜基质培养基包被。

在组织培养罩中干燥15分钟。使用前用1×PBS洗涤盖玻片一次。将细胞接种于包被有基底膜培养基的盖玻片上，细胞融合度为50%至60%。

始终向含完整RPMI培养基的接种细胞悬液中加入200纳摩尔的PMA。接种细胞后，将含有细胞的培养皿置于CO2培养箱中孵育12至24小时。第二步是用syntaxin-13质粒转染细胞。

将含有DNA和转染试剂的枪头置于室温孵育，混合5分钟，期间避免反复吹打。在30分钟孵育过程中，每隔10分钟用手轻轻敲击离心管一次。孵育期间，用1× PBS洗涤细胞两次，再用OPTI-MEM洗涤一次，然后向细胞中加入1 mL OPTI-MEM。

孵育30分钟后，将转染试剂-DNA混合物逐滴加入细胞中，并覆盖培养皿。在37°C条件下继续孵育细胞6小时。吸除含有转染试剂的OPTI-MEM培养基，加入补充有200 nmol/L PMA的完全RPMI培养基。

将细胞在 37 摄氏度下孵育 48 小时。第三步是细胞固定。请注意，以下操作在组织培养罩外进行。

转染48小时后，用1×PBS洗涤细胞两次，然后用3%甲醛固定细胞30分钟。固定后，再用1×PBS洗涤细胞两次，并将盖玻片保存在1×PB中备用。或者，可将细胞封片于玻片上，或在4摄氏度下保存。

第四步是细胞的免疫染色。准备一个湿盒。在培养皿中的滤纸上放置一块裁剪好的帕拉膜。

用铝箔覆盖。准备 25 微升一抗溶液，在一抗稀释比例为 1:200 的条件下加入一抗。

将此溶液以液滴形式加至湿润室中封口膜上。用镊子小心地提起盖玻片，将其倒置在一滴一抗染色溶液上，然后盖上湿润室的盖子。

室温孵育30分钟。同样，将二抗溶液按1:500稀释，在湿盒内将溶液滴加在封片旁的Parafilm上。若需对细胞核进行染色，可将DAPI按1:20,000至1:30,000的稀释比例加入溶液中。

用镊子小心地从一抗溶液中取出盖玻片，将其在 1× PBS 中浸洗两次。将盖玻片在纸巾上轻拍，以去除多余的 PBS。随后将其放入湿盒中的二抗染色液中，避免暴露于光线下，因为溶液中含有荧光标记的抗体。

孵育结束后，小心地从二抗溶液中取出盖玻片，然后在1× PBS中浸洗两次。接着将盖玻片轻轻在纸巾上轻拍，以去除多余的PBS。取12微升成像试剂滴加到载玻片上，再小心地将染色后的盖玻片放置在封片试剂上。

将载玻片倒置在纸巾上，然后轻轻按压。接着，使用荧光显微镜对盖玻片进行成像，并利用 ImageJ 分析图像。第六步是定量分析定位于再循环内体的蛋白质与黑色素体之间的共定位。

STX13-Δ129 与黑色素体共定位的定量分析。在小鼠野生型黑素细胞中进行 syntaxin-13 的免疫荧光显微观察，结果显示 GFP-tagged syntaxin-13 野生型定位于囊泡状和管状结构，而 GFP-tagged syntaxin-13 Δ129 除细胞表面外，还定位于环状结构。

此外，在明场成像的黑色素体中，细胞内环状的GFP-syntaxin-13 delta-129与黑色素体蛋白TYRP1表现出共定位。如前所示，过表达的GFP-syntaxin-13野生型有一部分存在于黑色素体中。为测量GFP-syntaxin-13野生型和GFP-syntaxin-13 delta-129在黑色素体中的相对定位情况，使用了Fiji软件，并通过JACOP插件进行分析。

测量得到的GFP-syntaxin-13 delta-129与TYRP1之间的曼德重叠系数（即MOC）比GFP-syntaxin-13野生型与TYRP1之间的MOC约高1.5倍。有趣的是，TYRP1与GFP-syntaxin-13 delta-129的MOC值比与GFP-syntaxin-13野生型相比高出2.9倍。这些数据表明，在稳态下，GFP-syntaxin-13 delta-129在黑色素体上的定位相对高于GFP-syntaxin-13野生型。

定量分析 syntaxin-13 野生型在再循环内体中的定位。GFP-syntaxin-13 野生型的免疫荧光显微结果显示其与已知的再循环内体蛋白 Rab11 共定位。GFP-syntaxin-13 野生型与 mCherry-Rab11 之间的 MOC 值相比 mCherry-Rab11 与 GFP-syntaxin-13 野生型的 MOC 值约高 1.4 倍。

为了测量GFP-syntaxin-13野生型阳性早期内体管状结构的数量和长度，使用Fiji软件进行分析，具体操作如方案部分所述。实验中以mCherry-Rab11作为阳性对照。转染GFP-syntaxin-13野生型的黑色素细胞中，每细胞的管状结构数量较表达mCherry-Rab11的细胞更多。

然而，当细胞中共表达GFP-syntaxin-13野生型和mCherry-Rab11时，管状结构的数量减少。第七步是定量分析再循环内体的管状结构数量及其长度。当细胞中共表达GFP-syntaxin-13野生型和mCherry-Rab11时，管状结构的数量减少。

有趣的是，在单独或共同表达的细胞中，GFP-syntaxin-13 野生型与 mCherry-Rab11 的平均小管长度彼此相近。综上所述，这些数据表明 GFP-syntaxin-13 野生型与 Rab11 类似，定位于再循环内体。本研究显示，syntaxin-13 突变体的 N 端递送形式（即 GFP-syntaxin-13 delta-129）定位于黑色素体，GFP-syntaxin-13 delta-129 可能可作为从再循环内体向细胞表面和溶酶体相关细胞器（LRO）囊泡运输的报告分子。

相比之下，GFP-syntaxin-13 野生型与 Rab11 类似，定位于再循环内体。本研究说明，GFP-syntaxin-13 野生型也可用于标记黑素细胞中的再循环内体。由于 Rab11 会改变内体动力学，因此 GFP-syntaxin-13 野生型可能是比 Rab11 更优的再循环内体标记物。

综上所述，GFP-突触素-13 野生型可作为潜在的循环内体标记物，用于研究稳态条件下的动态过程。